Fare Beyin tümör Neurospheres kullanarak yerel Kromatin Immunoprecipitation
Summary
Epigenetik mekanizmalar sık tümörü değişmiş. Kromatin immunoprecipitation Kromatin yapısı ve gen transkripsiyonu düzenleyen Histon modifikasyonlar değişimler sonucu genetik değişiklikler gliyom içinde sonuçlarını incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı yerel Kromatin immunoprecipitation fare Beyin tümör neurospheres üzerinde açıklar.
Abstract
Epigenetik değişiklikler geliştirme ve tümörü ilerlemesini ve tutulabilir. Metilasyonu ve asetilasyon rehberleri ve oncogenes ve tümör bastırıcılarının düzenleyici bölgelerinde değişiklikler gen ekspresyonu değişikliklere yol ve Beyin Tümörleri patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Yerel Kromatin immunoprecipitation (ChIP) değişiklikler veya diğer proteinler DNA için sıkı bir şekilde bağlı algılanmasını sağlar popüler bir tekniktir. Çapraz bağlı yongasında yerli çip, aksine hücre kovalent protein DNA’yı bağlamak için formaldehit ile kabul edilmediği. Bu avantajlı çünkü bazen çapraz sadece geçici DNA ile etkileşim ve işlevsel öneme gen yönetmelikte var mı proteinler giderebilir. Buna ek olarak, antikorlar genellikle karşı sabitlenmemiş peptidler yetiştirilir. Bu nedenle, antikor özgüllük yerli yongasında arttı. Ancak, yerel çip sadece Histon veya sıkıca bağlamak için DNA diğer proteinler eğitimi için geçerli olduğunu unutmayın tutmak önemlidir. Bu iletişim kuralı yerel Kromatin immunoprecipitation fare Beyin tümör neurospheres üzerinde açıklar.
Introduction
Epigenetik olaylar gliomas sık sık ve büyük olasılıkla tümör patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Nitekim, pediatrik yüksek kalitede gliyom içinde Histon değişik H3.3 ve H3.1 kodlama genlerdeki mutasyonlar sık1oluşur. Mutasyonlar Histon değişiklikler etkiler ve büyük epigenetik sonuçların2,3var. İçinde ergen için yetişkin spektrum, ATRX ve sergi gibi diğer Kromatin düzenleyiciler içinde genetik değişiklik ve tekrarlayan isocitrate dehidrogenaz gen 1/2 (IDH1/2), α-KG bağımlı Histon ve DNA de-methylasaes inhibe bir mutasyon mutasyonların meydana 4. bu nedenle, nasıl epigenetik düzenleyicileri etkiler mutasyonlar Kromatin yapısı ve düzenleyici Histon değişiklikler, daha, buna karşılık, tümör hücreleri transcriptome dramatik bir etkiye sahip alter eğitim için kritik öneme sahiptir.
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) genom5,6,7epigenetik değişikliklerin etkisini değerlendirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. Yerel yongası, Kromatin micrococcal nükleaz (MNase), faiz, protein karşı harekete geçirilen bir antikor kullanarak immunoprecipitated ile sindirmek ve DNA immunoprecipitated Kromatin karmaşık6sonra saf. Bu teknik yalnızca sıkı bir şekilde DNA6ile etkileşim proteinlerin incelenmesi için geçerlidir bu yüzden hücreleri işlem sırasında sabit değildir. Antikorlar genellikle sabitlenmemiş peptidler veya protein7karşı başlatılan bu yana cross-linking yokluğu antikor özgüllük yardımcı olur. Buna ek olarak, cross-linking hiçbir adım olduğundan, bu belirsiz ve değil düzenleyici7,‘ i8geçici protein-DNA etkileşimleri sabitleme şansını azaltır. Çip Histon değişiklikler belirli bir genomik bölgesinde zenginleştirme tanımlamak için kullanılabilir. Burada, genetik olarak üretilen neurospheres (NS) yerel ChIP performans mühendislik gliyom fare modelleri için bir protokol ayrıntılı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan Protokolü NS genetiği Beyin Tümörleri türetilen yerel çip gerçekleştirileceği kullanıcı sağlayacaktır. ChIP cross-linking aksine, bu iletişim kuralı için sıkı bir şekilde DNA6ile ilişkilendirmek proteinlerin çalışma sınırlıdır. Kullanılan hücre sayısını gerektiği şekilde değiştirilebilir ve protokol ölçeklendirilebilir. Biz IP başına 1 X 106 hücre kullanılan, ancak, yerel ChIP kadar az 4 x 104 hücreleri<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal kurumları, sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar & kontur (NIH/NINDS) hibe R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 için M.G.C. tarafından desteklenen; NIH/NINDS verir R01-NS076991, R01-NS082311 ve R01-NS096756 P.R.L. için; NIH/NINDS R01-EB022563; Nörocerrahi bölümü; Leah’ın Happy Hearts ve Chad rağmen Vakfı’na M.G.C. ve P.R.L. RNA Biyomedikal Grant F046166 M.G.C. F.M.M. için bir F31 NIH/NINDS-F31NS103500 tarafından desteklenmektedir. R.I.Z.-V. NIH tarafından desteklenen / NIGMS vermek 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
