Apresentam-se aqui detalhados protocolos para a linha de celular de 32G/G-CSF-R precursor mieloide murino de cultivo, realizando a infecções virais e realizar ensaios de proliferação e diferenciação. Esta linha de celular é adequada para estudar o desenvolvimento de células mieloides e o papel dos genes de interesse no crescimento de células mieloides e diferenciação neutrofílica.
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Artigo de método
Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreensão da hematopoiética estaminais e progenitor da biologia das células tem implicações importantes para o tratamento de patologias hematológicas e medicina regenerativa. Apesar dos dados mais relevantes que podem ser adquiridos usando modelos na vivo ou culturas primárias, a baixa abundância de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas restringe consideravelmente a piscina de técnicas adequadas para sua investigação. Portanto, o uso de linhas celulares permite produção suficiente de material biológico para o desempenho das seleções ou ensaios que requerem números de células grandes. Aqui apresentamos uma descrição detalhada, leitura e interpretação de ensaios de proliferação e diferenciação, que são utilizados para a investigação dos processos envolvidos na myelopoiesis e diferenciação neutrofílica. Estas experiências empregam a linha de célula mieloide murino dependente de citocinas 32G/G-CSF-R, que possui a habilidade de se proliferam na presença de IL-3 e se diferenciam em G-CSF. Nós fornecemos otimizado de protocolos para a manipulação de células de 32G/G-CSF-R... e discutir as principais armadilhas e inconvenientes que possam comprometer os ensaios descritos e os resultados esperados. Além disso, este artigo contém protocolos para produção de Lentivirus e retroviral, titulação e transdução de células de 32G/G-CSF-R. Demonstramos que manipulação genética destas células pode ser empregada com sucesso realizar estudos moleculares e funcionais, que podem complementar os resultados obtidos com primárias células tronco e progenitoras hematopoiéticas ou modelos na vivo .
Introdução
A população de tronco e progenitoras hematopoiética fornece o organismo com uma grande variedade de células maduras, incluindo as células da linhagem mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos). O processo que conduz à produção de células mieloides das pilhas de haste hematopoietic é conhecido como myelopoiesis, e produção adequada de células mieloides maduras, em resposta às novas demandas é um pré-requisito para o enfrentamento adequado do organismo com o stress condições, tais como infecções e perda de sangue. Produção insuficiente de células mieloides maduras pode levar à incapacidade de eliminar os agentes patogénicos, coagulação sanguínea reduzida....
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Protocolo
Nota: Passos descrevendo a expansão, diferenciação e transdução de 32G/G-CSF-R células são apresentados abaixo.
1. preparação
- Preparação de meios de comunicação
- Preparar 250 mL de meio de cultura: suplementado com 10% de calor 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) inativada FBS (soro fetal bovino) e IL-3 murino (10 ng/mL).
- Como alternativa, use o caseiro IL-3. Para produzir caseiras IL-3, transduce células HEK293 com vetor expressando IL-3 e IL-3 contendo sobrenadante22de recolher.
Nota: Os antibióticos, como a penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 µ g/mL)....
- Como alternativa, use o caseiro IL-3. Para produzir caseiras IL-3, transduce células HEK293 com vetor expressando IL-3 e IL-3 contendo sobrenadante22de recolher.
- Preparar 250 mL de meio de cultura: suplementado com 10% de calor 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) inativada FBS (soro fetal bovino) e IL-3 murino (10 ng/mL).
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Resultados
Proliferação e diferenciação das células de 32G/G-CSF-R
Para avaliar a proliferação de células de 32G/G-CSF-R condições pro-proliferativa e pro-diferenciação, 32G/G-CSF-R as células foram cultivadas em meios contendo IL-3 e G-CSF, respectivamente. Observou-se que as células cultivadas num meio contendo de IL-3 (10 ng/mL) dividem aproximadamente cada 24 h (Figura 2A). Após substituição da IL-3 com G-CSF.......
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Discussão
A escolha de um modelo experimental é uma das principais questões em investigação. Apesar de células primárias de animais e humanas são acreditadas para produzir os dados mais biologicamente relevantes, estes modelos podem envolver preocupações éticas e são frequentemente associados com procedimentos caros e/ou sofisticado isolamento/cultivo. As células primárias são limitadas em número e é dificil geneticamente manipulá-los. Além disso, as células primárias representam uma população heterogênea, composta de vários tipos.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores Obrigado Prof Ruud Delwel e Prof Ivo Touw por nos oferecer a linha celular 32G/G-CSF-R e Prof Daniel G. Tenen por fornecer-nos com a linha de celular Bosc23. Este trabalho foi financiado por doações da Agência Grant da República Checa (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, o apoio do Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências a Checa (RVO 68378050) ao MA-J, uma bolsa de GA UK (projeto n. º 341015) da Universidade Charles de Praga para o MK e uma bolsa de GA UK (projeto n. º 1278217) da Universidade Charles de Praga para PD.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio em pó RPMI 1640 | Merck, Kenilworth, NJ, EUA | T 121-10 | sem NaHCO3, com L-glutamina |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 15028 | |
| Opti-MEM I Meio de soro reduzido | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 31985-047 | L-glutamina, vermelho de fenol |
| Soro fetal bovino (FBS) | Laboratórios PAA (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) | MT35011CV | Para diferenciação de células 32D/G-CSF-R Soro |
| bovino fetal (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 10270 | Usado para cultura HEK293T, NIH3T3, células BOSC23 |
| Penicilina | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | P3032 | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | S9137 | Pó de sal de sulfato de estreptomicina |
| Gentamicina | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | G1914 | |
| murino IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA | 213-13 | |
| humano G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA | 300-23 | |
| Polietileninina | Polyscience, Warrington, PA, EUA | 23966 | Linear, MW 25.000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | H9268 | |
| Tripsina | VWR Chemicals, Radnor, PA, EUA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | E5134 | |
| Cristal violeta | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | C0775 | |
| Azul de tripano | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | T6146 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA) | D2650 | |
| May-Grü nwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Itália | 10802 |
Referências
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O.
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Reimpressões e permissões
