Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células
Summary
Aquí se presentan protocolos detallados para el cultivo de la línea de célula 32D/G-CSF-R precursor mieloide murinas, realizar infecciones virales y llevar a cabo ensayos de proliferación y diferenciación. Esta línea celular es conveniente para el estudio de desarrollo de las células mieloides y el papel de los genes de interés en el crecimiento de las células mieloides y diferenciación neutrofílica.
Abstract
Comprensión de la biología de células madre y progenitoras hematopoyética tiene implicaciones importantes para la medicina regenerativa y el tratamiento de patologías hematológicas. A pesar de los datos más relevantes que se pueden adquirir con modelos en vivo o cultivos primarios, la baja abundancia de células madre y progenitoras hematopoyéticas restringe considerablemente el conjunto de técnicas apropiadas para su investigación. Por lo tanto, el uso de líneas celulares permite suficiente producción de material biológico para la realización de pruebas o ensayos que requieren un número grande de células. Aquí presentamos una descripción detallada, lectura e interpretación de ensayos de proliferación y diferenciación que se utilizan para la investigación de los procesos implicados en la diferenciación neutrofílica y mielopoyesis. Estos experimentos emplean la línea de células mieloides murinas dependiente 32D/G-CSF-I del cytokine, que posee la capacidad de proliferar en presencia de IL-3 y diferenciar en el G-CSF. Ofrecemos protocolos optimizados para manipular células 32D/G-CSF-R y discutir los principales escollos e inconvenientes que pudieran comprometer el análisis descritos y los resultados esperados. Además, este artículo contiene protocolos de producción lentivirales y retroviral, titulación y transducción de las células 32D/G-CSF-R. Demostramos que la manipulación genética de estas células puede emplearse para realizar con éxito los estudios funcionales y moleculares, que pueden complementar los resultados obtenidos con primarias células madre y progenitoras hematopoyéticas o modelos en vivo .
Introduction
La población de madre y progenitoras hematopoyética suministra al organismo una gran variedad de células maduras, incluyendo las células del linaje mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos). El proceso que impulsa la producción de células mieloides de las células madre hematopoyéticas se conoce como mielopoyesis y producción adecuada de células mieloides maduras en respuesta a las cambiantes demandas es un prerrequisito para el adecuado afrontamiento del organismo con el estrés condiciones, como infecciones y la pérdida de sangre. Producción insuficiente de células mieloides maduras puede provocar incapacidad para eliminar patógenos, coagulación de la sangre y otros mortales condiciones1,2. Además, alteraciones en el desarrollo del linaje mieloide también pueden ser asociadas con malignidades hematológicas, tales como la leucemia mieloide aguda (AML)3. Alteraciones en la mielopoyesis pueden ocurrir debido a diversas razones, tales como defectos en células receptores de la superficie4, expresiones alteradas de transcripción factores5, deterioraron señalización vías6, dando por resultado la formación de mutaciones / activación de oncogenes7o inactivación de genes de supresor de tumor8.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar desarrollo mieloide y evaluar el efecto de las alteraciones genéticas específicas en este proceso. Métodos comunes utilizados para el estudio de la mielopoyesis consisten en células primarias y ratones transgénicos. Aunque estos modelos permiten la adquisición de datos biológicamente relevantes, tienen ciertas limitaciones. El uso de pilas encuentra con un número limitado de células y un período restringido de la cultura, estrechamiento de las posibilidades para alterar la expresión génica y posterior análisis biológico o bioquímico. Ratones transgénicos son costosas y requieren un grado razonable de justificación biológica. Además, trabajar con modelos en vivo añade un grado de complejidad al entender el papel de un gen de interés en un proceso dado. Por lo tanto, se necesitan alternativas para sortear estas limitaciones. Las líneas celulares tienen indiscutibles ventajas: (1) que poseen la capacidad de proliferación ilimitada que permite generar suficiente material para estudios bioquímicos y biológicos, (2) son susceptibles a la manipulación genética (caída, golpe de gracia, la sobreexpresión), (3) el costo es relativamente bajo, y (4) permiten un grado de simplificación biológica necesaria en ciertas aproximaciones experimentales.
La IL-3 padres (interleucina-3) 32D dependiente celular fue establecida en 1983 por Greenberger y colegas por la infección de células de médula ósea de los ratones C3H/HeJ amigo de virus de leucemia murina9. Varios clones 32D fueron descritos en la literatura: cl 2393 cl10y cl 1011. Las células de cl-3 32D mostraron proliferan en IL-3 y experimentan diferenciación neutrofílica sobre el tratamiento con estimulación de granulocitos factor (G-CSF)10. Por el contrario, 32D cl-10 células, siendo dependiente de la IL-3, originalmente no se diferencian en respuesta al tratamiento de G-CSF. En 1995 el grupo del Dr. Ivo Touw retrovirally transduced 32D cl-10 células tipo salvaje y mutante del receptor G-CSF (G-CSF-R), con el fin de identificar regiones funcionalmente importantes de este receptor11. Este estudio dio lugar a la generación de las células 32D/G-CSF-R, que son igualmente dependientes de IL-3, pero dentro de 6 a 10 días después del reemplazo de IL-3 con G-CSF, células para proliferar y diferenciarse irreversiblemente en neutrófilos maduros. Estas propiedades hacen 32D cl-3 y modelos simplificados 32D/G-CSF-R células de diferenciación neutrofílica murino que puede ser modulada por dos bien definido crecimiento y factores de diferenciación – IL-3 y G-CSF. Durante las últimas décadas varios grupos han utilizado células 32D/G-CSF-R para el estudio de la función de genes particulares en proliferación y diferenciación de las células mieloides en cultura12,13,14,15 , 16y para el estudio de G-CSF señalización17,18. Importante, los resultados obtenidos en esta línea celular se correlacionan con datos obtenidos con células primarias y ratones transgénicos16,19,20,21. En consecuencia, creemos que las células 32D/G-CSF-R, un modelo ampliamente utilizado y bien establecida, representan un sistema valioso para estudiar diferenciación mieloide que puede utilizarse en paralelo con otros enfoques de abordar esta cuestión.
Aquí, se presenta protocolos detallados que describen el manejo de la línea celular 32D/G-CSF-R, que cubierta de expansión, diferenciación y evaluación de la proliferación y diferenciación de estas células. Información detallada de la modificación genética de células 32D/G-CSF-R, ya sea por transducción retroviral o lentivirales, así como protocolos para la titulación de virus se proporcionan. Además, disponen de varios resultados representativos que muestran posibles aplicaciones de las células 32D/G-CSF-R.
Protocol
Representative Results
Discussion
La elección de un modelo experimental es uno de los temas principales en la investigación. Aunque las células animales y humanas primarias se creen para producir los datos más relevantes, estos modelos pueden incluir preocupaciones éticas y a menudo se asocian a procedimientos costosos y sofisticados aislamiento/cultivo. Células primarias son limitadas en número y es difícil manipularlos genéticamente. Además, las células primarias representan una población heterogénea compuesta por diversos tipos celulares …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen Prof. Ruud Delwel y Prof. Ivo Touw por facilitarnos la línea 32D/G-CSF-R celular y Prof. Daniel G. Tenen por facilitarnos la línea celular de Bosc23. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia de donación de la República Checa (GACR 15-03796S y GACR 17-02177S) a MA-J, el apoyo del Instituto de Genética Molecular de la Academia Checa de Ciencias (RVO 68378050) a MA-J, una beca de Reino Unido GA (proyecto no. 341015) de la Universidad de Charles en Praga a MK y una beca de Reino Unido GA (proyecto Nº 1278217) de la Universidad de Charles en Praga a PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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