Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón
Summary
En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.
Abstract
Fuga vascular y extravasación de plasma, tiene un número de causas y puede ser una grave consecuencia o síntoma de una respuesta inflamatoria. Este estudio en última instancia puede conducir a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. Es importante que los investigadores tienen las herramientas adecuadas, incluyendo los mejores métodos disponibles para el estudio de la extravasación de plasma. En este artículo, se describe un protocolo, utilizando el método de colorante azul de Evans, para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN. Este protocolo es intencionadamente simple, a tan grande un grado de lo posible, pero proporciona datos de alta calidad. Colorante azul de Evans ha sido elegido principalmente porque es fácil para el laboratorio de media utilizar. Hemos utilizado este protocolo para proporcionar evidencia y apoyo a la hipótesis de que la neprilysin de enzima puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma. Sin embargo, este protocolo puede usar experimentalmente y fácilmente adaptado para el uso en otras cepas de ratones o en otras especies, en muchos diversos órganos o tejidos para estudios que pueden involucrar otros factores que son importantes para entender, prevenir o tratar la extravasación de plasma. Este protocolo ha sido ampliamente optimizado y modificado de los protocolos existentes y combina fiabilidad, facilidad de uso, economía y disponibilidad general de materiales y equipos, hacer superior para el laboratorio de media utilizar en el presente Protocolo cuantificación de la extravasación de plasma de órganos.
Introduction
Fuga vascular en los órganos se refiere a extravasación o salida de plasma sanguíneo a través de brechas en el endotelio de post vénulas capilares en los órganos. Esta extravasación de plasma o el aumento de la permeabilidad vascular, que puede surgir de algún tipo de respuesta inflamatoria, puede tener graves consecuencias. Por lo tanto, es importante que este fenómeno, sus causas, moduladores y consecuencias, están estudiadas y entendidas, y además, que los investigadores tienen buenas herramientas y protocolos con los que estudiar. Las brechas endoteliales pueden ser producidas a través de una serie de estímulos, pero generalmente se producen por la acción de neurotransmisores péptido o taquicininas en el endothelia. Uno de los principales mediadores naturales de este proceso, que resulta en extravasación de plasma mayor, es el undecapeptide taquiquinina neuropéptido sustancia P1.
Métodos para investigar y medir la permeabilidad vascular o extravasación de plasma, que utilizan la propiedad de unión a albúmina del colorante azul de Evans, se han desarrollado y generalmente son conocidos por su precisión, sencillez, economía, seguridad y capacidad de permitir que el determinación de la extravasación de plasma de varios tejidos a la vez, si es así deseado2,3,4,5,6,7,8,9 . Este protocolo de azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN utiliza todos estos, pero añade algunas modificaciones importantes que lo hacen generalmente útil y adaptable para estudios futuros, el laboratorio promedio lleva a cabo o que llevar a cabo importantes estudios de factores asociados a la extravasación de plasma o en la permeabilidad vascular. En este protocolo, sustancia P es introducida a los ratones a 1 nmol/kg, lo que aumenta la extravasación de plasma por 1.5. Esto aumenta la sensibilidad del Protocolo, dando por resultado más fácilmente observables y obtener resultados. Otros factores que afectan a la permeabilidad, como varios otros péptidos, productos químicos o algunas formas de lesión tóxica, pueden ser utilizados o estudiados por otros laboratorios, como se desee. En este protocolo para introducir el azul de Evans y sustancia P sistémica, que requiere cirugía terminal se utilizan inyecciones de vena yugular. Sin embargo, las inyecciones de vena yugular5,7,10, incluso después de la consideración de las necesarias técnicas quirúrgicas terminal, son fáciles de dominar y conducir a la producción de resultados más consistentes que otra las inyecciones venosas, incluyendo cola vena inyecciones4,9. Aunque es posible de azul de Evans ser entregados por las inyecciones del seno venoso orbital retro, no hay referencias en la literatura han encontrado que utilizar este método de entrega de azul de Evans. Sin embargo, en cuanto a las inyecciones de vena de la cola, el alto grado de conocimientos y práctica reproducible dominar esta técnica muy limita su uso para inyección de azul de Evans exitosa. En contraste, el método de inyección de la vena yugular alternativos como se describe en nuestro protocolo, ofrece una solución técnicamente obtenible. Un procedimiento crucial para la perfusión de las venas del ratón, realizado justo después del sacrificio del ratón de perfusión de azul de Evans, elimina el exceso de tinte de azul de Evans y se ha estandarizado en el presente Protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusión han sido cuidadosamente examinados y modificado para conocer el presente procedimiento. Otras modificaciones que se describen aquí son todo optimizado, simple y de bajo costo.
Existen algunas limitaciones importantes del método de colorante azul de Evans. Por ejemplo, baja sensibilidad a veces asociado con este método puede prevenir algunos adicional examen macroscópico patológico e histológico de los tejidos de los animales de inyección de azul de Evans. Sin embargo, estas y otras limitaciones han llevado al desarrollo de métodos alternativos y modelos que, sin embargo, todavía utilizan el azul de Evans. La medición de azul de Evans por fluorescencia (en lugar de alcance visual) espectroscopia puede aumentar la sensibilidad del método. Además, microscopía de fluorescencia de los tejidos teñidos de azul de Evans fue desarrollado para permitir la observación de fuga vascular en más distintas ubicaciones11. Además, todo el cuerpo la proyección de imagen y escaneo de un animal vivo previamente inyectaron con Evans azul12 permite la investigación de las concentraciones de azul de Evans en una manera continua, en lugar de en uno elegido tiempo punto específico del experimento. Sin embargo, este método requiere la disponibilidad de instalaciones adecuadas de imagen y puede ser muy costoso. Modificaciones que Evans blue y realizada en un tipo de in vitro del modelo, como en una celda de cultura o chick corioalantoideas modelo13 (CAM) también se han descrito. Estos modelos son monitoreados por fluorescencia y microscopia intravital14 y permiten la cuantificación de cambios en la permeabilidad vascular con el tiempo, pero pueden plantear preguntas sobre modelado preciso de condiciones en vivo y también puede caro.
Ha habido otros métodos desarrollados para determinar y cuantificar fuga vascular o permeabilidad, que implica la administración de azul de Evans. Estos métodos pueden emplear una adecuada molécula fluorescente (como la albúmina o fluoresceína) o una molécula etiquetada isotópicamente etiquetada o no, a los animales vivos (o para la célula cultura o corioalantoideas (CAM) modelos13, seguido de no invasivo proyección de imagen (PET-TAC, resonancia magnética, microscopía intravital, escaneo de cuerpo entero) o por proyección de imagen invasivas (microscopia fluorescente)3,12,15. Aunque estas técnicas pueden ofrecer a una serie de ventajas sobre otros Evans métodos azul, también tienen desventajas, que pueden incluir su considerable complejidad, conocimientos necesarios, recursos y altos costos monetarios.
Neprilysin16 (la peptidasa enzima NEP, también conocido como CD10, MME o Enkephalinase) se ha sugerido para ser implicados en la inhibición de extravasación de plasma, al menos en parte, a través del metabolismo enzimático y la inactivación de sustancias endógenas Así, en los tejidos en que ocurre la peptidasa superficie celular NEP, puede haber una atenuación del efecto de la sustancia P, probablemente por la actividad de la peptidasa de NEP.
Al principio, probamos para la extravasación de plasma inducido por la sustancia P utilizando este protocolo modificado de Evans blue, con FVBN tipo salvaje (WT) y ratones knockout (KO) de NEP. Participación de la NEP en extravasación de plasma aumentada de sustancia P fue sospechada de estos estudios iniciales, y describimos a estos y otros experimentos papel de NEP participación en extravasación de plasma. Sin embargo, el foco de este manuscrito no es NEP o su papel en la extravasación de plasma, pero más bien la extravasación de plasma experimentos ellos mismos. Los resultados de la NEP son representante de la clase de resultados que pueden obtenerse mediante el uso de este protocolo modificado. El método de azul de Evans para medir la extravasación de plasma ha sido optimizado y modificado, como se describe en detalle a continuación para los ratones FVBN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como hemos comentado anteriormente, el estudio de la extravasación de plasma en última instancia puede llevar a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. El uso acertado del Protocolo de extravasación de plasma (arriba), utilizando medio de contraste azul de Evans, se ha demostrado en el manuscrito actual. Aunque los datos se muestra de nuevo la hipótesis de que la NEP puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma, este es un objetivo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Andy Poczobutt y Dr. Jori Leszczynski por su valiosa ayuda y ediciones a este manuscrito. Apoyado por subvenciones recibidas desde el corazón nacional, pulmón y Blood Institute (NHLBI to1 HL078929, PPG HL014985 y HL095439 RO3) y el Departamento de Veterans Affairs (de mérito).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Referências
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