Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시
Summary
여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.
Abstract
혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.
우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.
Introduction
Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막1,,23에 의해 수 있습니다. EC 레이어 luminal (혈액 연결)와 abluminal (뇌 연결 막) 대 한 구체적이 고 vectorial 전송 기능4,5 수 있도록 다양 한 전송기의 분포에 관하여 매우 편광은 . BBB 단단히 CNS 환경 규제에 대해 보호 하는 동안, CNS 약물 전달 기능 BBB와 파 킨 슨 등 질환에 대 한 주요 도전 이다. BBB 장애와 신경 질환에도 장벽 부전 손상 Alzheimer의 질병 (광고)에서 예를 들어 특정 전송 대상에 포함 될 수 있습니다 때문에 특히 두뇌 약물 전달 증가 추측 될 수 없다. 광고에서 LRP1, 분노, P-gp 등 여러 가지 아 밀 로이드 베타 전송기 dysregulated 것으로 알려져 있습니다 하 고 쓸데6,,78수 있습니다 따라서 이러한 전송기를 대상으로 합니다. BBB는 획, 광고, 수 막 염, 다 발성 경화 증 및 뇌 종양9,,1011등 여러 신경 질환에 손상 이다. 장벽 기능 복원 치료 전략의 중요 한 부분 이며 따라서 그 평가 중요 한.
이 작품에서는, 우리는 설명 된 객관적이 고 침투성 분석 결과 우리가 성공적으로 적용할 여러 마우스 라인 모두 실험과 유전자 변형 질환 모델10,12,13 설치류에 대 한 양적 프로토콜 ,14. 방법은 혈관 칸막이 추적기를 제거 뒤에 쥐의 관류 형광 추적기의 간단한 복 주사를 기반으로 합니다. 뇌 및 기타 장기 수집된 게시물 관류 및 침투성 객관적인 평가 절대 침투성 인덱스 플레이트 리더에서 조직 homogenates의 형광 측정에 따라 있습니다. 모든 원시 형광 값 조직 homogenates 또는 어떤 추적 프로그램에는 영향을 받지 않는 가짜 동물에서 혈 청을 사용 하 여 배경색을 수정할 수 있습니다. 충분 한 정규화 세럼 볼륨, 혈 청 형광, 및 조직, 따라서 저조한 침투성 인덱스를 완전 하 고 실험 및 조직 유형 사이 비교의 무게에 대 한 포함 되어 있습니다. 그룹 사이 비교의 용이성, 절대 침투성 인덱스 값 수 쉽게 변형 될 비율을 우리12이전 수행 했다. 동시에, 저장 된 hemi-두뇌와 신장 수 활용할 수 추적 프로그램 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법10. 고전적인 형광 현미경 검사 법 이기는 하지만 조직 단면도 및 반 정량 분석에 대 한 이미지의 주관적인 선택으로 인해 성가신 침투성에 지역 차이 얻기에 중요 한 될 수 있습니다. 자세한 단계는 프로토콜에서 제공 됩니다 그리고 적절 한 노트 추가 됩니다. 이 성공적으로 다른 작은 동물을 확장할 수 있는 쥐에서 vivo에서 침투성 시험을 수행 하기 위한 필요한 정보를 제공 합니다. 분석 결과 추적기의 많은 종류에 적용 될 수 있습니다 추적기와 독특한 형광 스펙트럼의 조합에 의해 침투성 평가 기반으로 책임과 크기에 대 한 허용.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지17</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Sphingonet 컨소시엄이이 작업을 지원 하기 위한 Leduq 기초에 의해 투자를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 또한 “혈관 차별화 및 리 모델링” 공동 연구 센터에 의해 지원 되었다 (CRC / Transregio23, 프로젝트 C1)와 7. FP, COFUND, 괴테 국제 Postdoc 프로그램 이동-IN, No. 291776 자금. 우리 더 처리 및 유전형 캐슬 린 서머를 한 쥐와 그녀의 기술 지원에 대 한 인정합니다.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
Referências
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