Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores
Summary
Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato – encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.
Abstract
Barreira hemato – encefálica (BBB) é uma barreira especializada que protege o microambiente do cérebro de toxinas e patógenos na circulação e mantém a homeostase do cérebro. Os principais locais da barreira são células endoteliais dos capilares cerebrais cuja função de barreira resulta de junções intercelulares apertadas e transportadores de efluxo expressados na membrana plasmática. Esta função é regulada por pericitos e astrócitos que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). Várias doenças neurológicas, como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD), tumores cerebrais estão associados uma função prejudicada do BBB. Avaliação da permeabilidade do BBB é, portanto, crucial na avaliação da gravidade da doença neurológica e o sucesso das estratégias de tratamento empregado.
Apresentamos aqui um simples ainda ensaio de permeabilidade robusto que foram aplicadas com êxito ao rato vários modelos ambos, genética e experimental. O método é altamente quantitativa e objectiva em comparação com a análise de fluorescência de traçador por microscopia que é comumente aplicada. Neste método, os ratos são injectados intraperitonealmente com uma mistura de aquosas inertes marcadores fluorescentes, seguido por anestesiar os ratos. Perfusão cardíaca dos animais é executada antes da colheita, cérebro, rins ou outros órgãos. Órgãos são homogeneizados e centrifugados seguido por medição de fluorescência de sobrenadante. Sangue da punção cardíaca antes de perfusão tem finalidade de normalização para o compartimento vascular. A fluorescência de tecido é normalizada para a molhado fluorescência peso e soro para obter um quantitativo índice de permeabilidade do traçador. Para confirmação adicional, o contralateral hemi-cérebro preservado para imuno-histoquímica pode ser utilizado para fins de visualização do traçador fluorescência.
Introduction
A barreira hemato – encefálica (BBB) consiste nas células endoteliais microvasculares (ECs), apoiadas por pericitos intimamente associados (PCs), que são ensheathed na lâmina basal, e astrócitos (ACs) que envolvem a membrana basal com os pés-final1 ,2. ECs interagirem com vários tipos de células que suportam e regulam a função de barreira, principalmente ACs e PCs, e também os neurônios e microglia, que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). O NVU é crítico para a função do BBB, que limita o transporte de sangue toxinas e patógenos de entrar no cérebro. Esta função é um resultado da junção apertada-moléculas como claudin-5, occludin, zonula occludens-1, que estão presentes entre o ECs e também devido à ação de transportadores como p-glicoproteína (P-gp) o efluxo moléculas que entram o endotélio de volta para o navio lúmen1,2,3. O BBB entretanto permite o transporte de moléculas essenciais como nutrientes (glicose, ferro, aminoácidos) por transportadores específicos expressados no CE membranas de plasma1,2,3. A camada de CE é altamente polarizada em relação a distribuição de vários transportadores entre o luminal (sangue-face) e abluminal (membranas voltados para o cérebro) para permitir o transporte específico e vectorial função4,5 . Enquanto o BBB é protetor com relação a regulação firmemente no meio do CNS, é um grande desafio para a entrega de drogas CNS em doenças como a doença de Parkinson com um BBB funcional. Mesmo em doenças neurológicas com disfunção do BBB, ele não pode ser considerado que a entrega de drogas do cérebro é maior, particularmente como a disfunção da barreira poderia incluir danos para as metas de transporte específico por exemplo, como a doença de Alzheimer (AD). No anúncio, vários transportadores de amiloide beta, como o LRP1, raiva, P-gp são conhecidos por ser prejudicado e direcionamento, portanto, estes transportadores pode ser fútil6,7,8. O BBB é prejudicado em várias doenças neurológicas como meningite de acidente vascular cerebral, AD, esclerose múltipla e tumores de cérebro9,10,11. Restaurar a função de barreira é uma parte crucial da estratégia terapêutica e, portanto, sua avaliação é fundamental.
Neste trabalho, descrevemos um objectivo e quantitativo protocolo para ensaio de permeabilidade em roedores que nós aplicada com êxito a várias linhas de rato ambos doença transgénicos e experimental modelos10,12,13 ,14. O método é baseado em uma simples injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes seguido de perfusão dos ratos para remover os marcadores do compartimento vascular. Cérebro e outros órgãos são coletados post perfusão e avaliados por um objectivo de permeabilidade e índice de permeabilidade absoluta com base nas medidas de fluorescência do tecido homogenates em um leitor de placa. Todos os valores de fluorescência crus são corrigidos para o plano de fundo usando o soro de animais de Souza que não recebem qualquer marcador ou tecido homogenates. Amplas normalizações são incluídas para o volume de soro, fluorescência de soro e o peso dos tecidos, produzindo assim o índice de permeabilidade absoluta e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. Para facilitar a comparação entre os grupos, os valores de índice de permeabilidade absoluta podem ser prontamente transformados rácios como tinha anteriormente foram realizadas12. Simultaneamente, armazenado hemi-cérebro e rim poderiam ser utilizados para visualização de traçador por microscopia de fluorescência10. A microscopia de fluorescência clássico pode ser valiosa na obtenção diferença regional na permeabilidade, embora complicado devido à seleção subjetiva de imagens para uma análise semi-quantitativa e seções do tecido. As etapas detalhadas são apresentadas no protocolo e notas são adicionadas quando necessário. Isto fornece as informações necessárias para executar com êxito o ensaio de permeabilidade em vivo nos ratos que podem ser escalados para outros pequenos animais. O ensaio pode ser aplicado a vários tipos de marcadores permitindo a carga e o tamanho com base em avaliação de permeabilidade por uma combinação de marcadores com espectros de fluorescência distintas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disfunção da barreira hemato – encefálica está associada com um número de doenças neurológicas, incluindo tumores cerebrais primários e secundários ou derrame. Repartição BBB é frequentemente associada com edema de CNS fatais. A elucidação dos mecanismos moleculares que acionam a abertura ou encerramento do BBB é, portanto, de importância terapêutica em doenças neurológicas e comumente investigado pelos pesquisadores. No entanto, métodos para investigar BBB permeabilidade na vivo relatados na…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer o consórcio Sphingonet, financiado pela Fundação para apoiar este trabalho de Leduq. Este trabalho também foi apoiado pelo centro de pesquisa colaborativa “diferenciação Vascular e remodelação” (CRC / Transregio23, projeto C1) e pela 7. FP, MULTIANUAIS, Goethe internacional Postdoc programa GO-IN, n. º 291776 financiamento. Reconhecemos mais Kathleen Sommer pela sua assistência técnica com ratos, manipulação e genotipagem.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
Referências
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