In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti
Summary
Qui presentiamo un’analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato – encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l’altro per la visualizzazione dell’elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.
Abstract
Barriera emato – encefalica (BBB) è una barriera specializzata che protegge il microambiente del cervello dalle tossine e agenti patogeni nella circolazione e mantiene l’omeostasi del cervello. I siti principali della barriera sono cellule endoteliali dei capillari del cervello cui funzione barriera risultati da giunzioni intercellulari strette e trasportatori di efflusso espressi sulla membrana plasmatica. Questa funzione è regolata da periciti e astrociti che insieme formano l’unità neurovascolare (NVU). Parecchie malattie neurologiche come l’ictus, morbo di Alzheimer (annuncio), i tumori cerebrali sono associati con un’alterata funzione BBB. Valutazione della permeabilità BBB è quindi cruciale nella valutazione della gravità della malattia neurologica e il successo delle strategie di trattamento impiegato.
Presentiamo qui un semplice eppure analisi permeabilità robusto che sono state applicate con successo a diversi mouse modelli entrambi, genetica e sperimentale. Il metodo è altamente quantitativa e oggettiva rispetto l’analisi di fluorescenza di tracciante da microscopia che è comunemente applicata. In questo metodo, i topi sono iniettati intraperitonealmente con un mix di traccianti fluorescenti inerti acquosi seguita da anestetizzare i topi. Aspersione cardiaca degli animali viene eseguita prima della raccolta del cervello, i reni o altri organi. Gli organi sono omogeneizzati e centrifugati seguiti dalla misura di fluorescenza dal surnatante. Disegnata dalla puntura cardiaca appena prima l’aspersione del sangue serve per scopo di normalizzazione per il compartimento vascolare. La fluorescenza del tessuto è normalizzata per la fluorescenza del siero e peso bagnata per ottenere un quantitativo indice di permeabilità del tracciante. Per ulteriore conferma, controlaterale hemi-cervello conservato per immunohistochemistry può essere utilizzato per scopi di visualizzazione dell’elemento tracciante di fluorescenza.
Introduction
Emato – encefalica (BBB) è costituito da cellule endoteliali microvascolari (ECs) supportate da periciti strettamente associati (pz), che sono ensheathed nella lamina basale, e astrociti (ACs) che avvolgono la membrana dello scantinato con i piedi di fine1 ,2. ECs interagire con diversi tipi di cellule che supportano e regolano la funzione di barriera, principalmente ACs e PC, e anche i neuroni e microglia, che insieme formano l’unità neurovascolare (NVU). Il NVU è critico per la funzione della barriera emato-encefalica, che limita il trasporto di ematica tossine e agenti patogeni di entrare il cervello. Questa funzione è un risultato di molecole di giunzione stretta come claudin-5, occludina, zonula occludens-1, che sono presenti tra ECs e anche a causa dell’azione dei trasportatori come la p-glicoproteina (P-gp) che efflusso molecole che entrano l’endotelio nuovamente dentro il vaso lumen1,2,3. Il BBB tuttavia consente il trasporto di molecole essenziali quali sostanze nutritive (glucosio, ferro, aminoacidi) dai trasportatori specifici espressi sul CE membrane plasmatiche1,2,3. Il livello di CE è altamente polarizzato rispetto alla distribuzione dei vari trasportatori tra il luminal (esposto a sangue) e abluminal (cervello esposto membrane) per consentire il trasporto vettoriale e specifica funzione4,5 . Mentre la BBB è protettiva per quanto riguarda strettamente che regolano il milieu di CNS, è una sfida importante per la somministrazione di farmaci CNS in malattie come il Parkinson con un funzionale BBB. Anche in malattie neurologiche con disfunzione BBB, non si può presumere che la consegna di droga del cervello è aumentata in particolare come la disfunzione della barriera potrebbe includere i bersagli di trasportatore specifico ad esempio come nel morbo di Alzheimer (annuncio). D.c., parecchi trasportatori di amiloide beta quali LRP1, RAGE, P-gp sono noti per essere dysregulated e quindi targeting questi trasportatori potrebbe essere inutile6,7,8. La BBB è alterata in diverse malattie neurologiche come meningite da ictus, annuncio, sclerosi multipla e nel cervello tumori9,10,11. Ripristinare la funzione di barriera è una parte cruciale della strategia terapeutica e così la sua valutazione è fondamentale.
In questo lavoro, abbiamo descritto un’oggettiva e quantitativa protocollo per l’analisi permeabilità nei roditori che abbiamo applicato con successo a numerose linee di mouse entrambi malattia transgenici e sperimentale modelli10,12,13 ,14. Il metodo si basa su una semplice iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione dei topi per rimuovere gli elementi traccianti dal compartimento vascolare. Cervello e altri organi sono raccolti post aspersione e permeabilità valutati da un obiettivo e indice di permeabilità assoluta basata su misure di fluorescenza degli omogeneati del tessuto in un lettore di piastra. Tutti i valori di fluorescenza grezzi vengono corretti per lo sfondo utilizzando omogenati o siero da animali di falsità che non ricevono alcun elemento tracciante. Le normalizzazioni di ampio sono incluse per volume del siero, di fluorescenza del siero e il peso dei tessuti, producendo così l’indice di permeabilità che è assoluto e comparabili tra esperimenti e tipi di tessuto. Per facilità di confronto tra i gruppi, i valori di indice di permeabilità assoluta possono essere trasformati prontamente ai rapporti come abbiamo in precedenza avevamo effettuato12. Contemporaneamente, stored hemi-cervello ed il rene potrebbe essere utilizzate per la visualizzazione dell’elemento tracciante da microscopia di fluorescenza10. La microscopia di fluorescenza classico potrebbe essere preziosa nell’ottenere differenze regionali nella permeabilità seppur ingombrante a causa della selezione soggettiva di sezioni di tessuto e immagini per un’analisi semi-quantitativa. I passaggi dettagliati sono presentati nel protocollo e se del caso, vengono aggiunte note. Questo fornisce le informazioni necessarie per eseguire correttamente il dosaggio di permeabilità in vivo in topi che possono essere ridimensionati per altri piccoli animali. Il dosaggio può essere applicato a molti tipi di rivelatori permettendo per la carica e la dimensione ha basato la valutazione di permeabilità da una combinazione di traccianti con spettri di fluorescenza distinti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disfunzione della barriera emato – encefalica è associata con una serie di disturbi neurologici, compreso i tumori cerebrali primari e secondari o ictus. Ripartizione BBB è spesso associata a edema CNS pericoloso. La delucidazione dei meccanismi molecolari che determinano l’apertura o chiusura della BBB è quindi di importanza terapeutica nelle malattie neurologiche e comunemente studiato dai ricercatori. Tuttavia, metodi per indagare BBB permeabilità in vivo segnalati nella letteratura, sono spesso associati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare Sphingonet consorzio finanziato dalla Fondazione Leduq per sostenere questo lavoro. Questo lavoro è stato anche sostenuto del Collaborative Research Center “differenziazione vascolare e rimodellamento” (CRC / Transregio23, progetto C1) e dalla 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programma GO-IN, no. 291776 finanziamenti. Riconosciamo ulteriormente Kathleen Sommer per la sua assistenza tecnica con i topi, manipolazione e genotipizzazione.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
Referências
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