הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש
Summary
אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.
Abstract
תרבויות מעיים מספק הזדמנות ייחודית לחקור את תא גזע המעיים וביולוגיה קריפטה בתחום החוץ, למרות שגישות יעילות לתמרן ביטוי גנים באורגנואידים עשו התקדמות מוגבלת בזירה זו. בעוד CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק של תאים לדור אורגנואיד, אסטרטגיה זו דורשת בחירה נרחבת והקרנה על ידי ניתוח רצף, אשר הוא גם זמן רב ויקר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך התמרה ויראלית יעילה של אורגנואידים מעיים. גישה זו מהירה ויעילה מאוד, ובכך מפחית את הזמן ואת ההוצאות הטמונות בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. אנו מציגים גם פרוטוקול כדי ליצור קטעים קפואים מן התרבויות אורגנואיד שלמים לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofluorggogtgggg, אשר יכול לשמש כדי לאשר ביטוי גנים או השתקה. לאחר התמרה מוצלחת של וקטורים ויראליות עבור ביטוי גנים או השתקה מושגת, תא גזע המעיים פונקציה קריפטה ניתן להעריך במהירות. למרות מחקרים אורגנואיד ביותר להעסיק בחוץ מבחנה, אורגנואידים יכול גם להיות מועברת עכברים עבור ניתוחים פונקציונליים vivo. יתר על כן, הגישות שלנו הם יתרון לניבוי תגובות טיפוליות לתרופות, כי כיום הטיפולים הזמינים בדרך כלל פונקציה על ידי ביטוי גנים מודולים או פונקציה חלבון ולא שינוי הגנום.
Introduction
היכולת לעכבר התרבות או האדם קריפטים תאים כתלת מימדי (3D) אורגנואידים מן המעיים או המעי הגס על פני תקופות זמן ממושך סיפק פריצת דרך גדולה כי תרבויות אלה להציג תכונות הגדרת אפיתל המעי ב vivo מיכל בן , מיכל השני , 3. אורגנואידים נגזר הקריפטטים הראשוניים מסוגלים לחידוש עצמי וארגון עצמי, המציגות פונקציות סלולריות דומה לרקמות המקור שלהם. אכן, אורגנואידים לאחר מכן לא רק את הארגון המבני של קריפטים בvivo, אלא גם תכונות מולקולריות רבות, ובכך לספק כלים שימושיים כדי ללמוד ביולוגיה נורמלית מדינות המחלה. כדי להמחיש, מחקרים אורגנואיד חשפו מסלולים מולקולריים מעורבים התחדשות רקמות1,2,3,4,5 כמו גם תרופות שיכולות לשפר את הפונקציה בהגדרות הפתולוגיים6,7.
המחקר של תאי גזע מעיים הוא עניין מיוחד, כי רירית המעיים היא בין רקמות המרגליות הגבוהה ביותר, חידוש עצמו כל 3-5 ימים כדי להגן על האורגניזם מפני חיידקים, רעלים, ופתוגנים אחרים בתוך ה מעיים לומן. תאי גזע מעיים (iscs) אחראים ליכולת הרגנרציה המדהימה הזאת ובכך לספק פרדיגמה ייחודית ללימוד הפונקציה של תא גזע מבוגרים1,2. השושלת-מעקב ניסויים בעכברים הפגינו כי מבודדים Lgr5-חיוביים בתאי גזע יכול להיות מתורבת כדי ליצור אורגנואידים 3D או ‘ מיני מעיים ‘ בתוך מבחנה אשר הם מקרוב מראה שלהם ב vivo עמיתיהם. תרבויות אורגנואיד יכול גם להיות נגזר של תא מעיים קריפטה מבודד מורכב של ושלתי, ISCs, ו Paneth תאים, האחרון אשר מהווים את התאים נישה אפיתל ב vivo. למעשה, תרבות אורגאידית מתאי המעי הראשי בקריפטה התפתחה לתוך טכניקה שגרתית יחסית קל ליישם ברוב המעבדות באמצעות ריאגנטים זמין נרחב. מודל זה הוא גם מקלה לניתוח כמותי של ביטוי גנים על ידי rna-רצף (rna-Seq) וחלבונים על ידי ספקטרומטר המסה, אימונוהיסטוכימיה, או אימונולואוורסטילהכתמים2,4,8. בנוסף, גנטיקה פונקציונלית ניתן ללמוד באמצעות רווח (ביטוי או הבעה גנים של הפעלת גן מוטציה) או אובדן של פונקציה (גנים השתקה או ביטוי של מוטציה אובדן פונקציה) גישות2.
חשוב מכך, יעילות נמוכה ורעילות גבוהה של דנ א סטנדרטי או פרוטוקולים של התמרה ויראלית עם polybrene להישאר משוכה גדולה בתחום. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק, גישה זו דורשת בחירה גוזלת זמן ואחריו אימות רצף9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיפי התמרה עבור אורגנואידים המעי הראשי הממוטב מסירה של חלקיקים ויראלי על ידי הקונקטוחלקיקים מגנטיים ויישום של שדה מגנטי. שינויי מפתח לפרוטוקולים קודמים4,5,10, 11,12,13 והמלצות כדי לשפר את היעילות מסופקים. אנו מתארים גם גישה ליצור קטעים קפואים מן האורגנואידים שלמים תרבותי ב-3D מטריצות (המכונה מעתה מטריקס קרום המרתף מטריצה או מטריצה) לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התרבות העיקרית של אפיתל המעי הבוגר כמו אורגנואידים מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים מעורב בתפקוד תא גזע, הומאוסטזיס אפיתל המעי, ו פתולוגיה1,2,3, ד. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה יכולה לשמש מהנדס גנטית אורגנואיד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), מרילנד תא גזע מחקר קרן (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), האגודה האמריקנית לריאות, רשת הבריאות של אלגני-ג’ונס הופקינס קרן מחקר ומחלות העיכול הופקינס מחקר בסיסי ליבה המחקר מרכז.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
