जमे हुए अनुभाग के लिए चुंबकीय नैनोकण ट्रांसडक्शन वायरल वेक्टर्स का उपयोग प्राथमिक माउस आंत्र organoids की जेनेटिक इंजीनियरिंग
Summary
हम करने के लिए कदम दर कदम निर्देश का वर्णन: 1) कुशलता से lenti- या retroviral transduction के लिए चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कर आंतों organoids इंजीनियर, और, 2) इंजीनियर organoids से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करते हैं. यह दृष्टिकोण बहाव प्रभाव की जांच के लिए organoids में जीन अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक बदलने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Abstract
आंत्र organoid संस्कृतियों आंतों स्टेम सेल और इन विट्रो में crypt जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं, हालांकि organoids में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए कुशल दृष्टिकोण इस क्षेत्र में सीमित प्रगति की है. जबकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी organoid पीढ़ी के लिए कोशिकाओं के सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देता है, इस रणनीति अनुक्रम विश्लेषण है, जो दोनों समय लेने वाली और महंगा है द्वारा व्यापक चयन और स्क्रीनिंग की आवश्यकता है. यहाँ, हम आंतों organoids के कुशल वायरल transduction के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण तीव्र और अत्यधिक कुशल है, इस प्रकार CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी में निहित समय और व्यय को कम करना। हम भी इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला, जो जीन अभिव्यक्ति या silencing की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ आगे विश्लेषण के लिए बरकरार organoid संस्कृतियों से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। जीन अभिव्यक्ति या silencing के लिए वायरल वैक्टर के सफल transduction के बाद हासिल की है, आंतों स्टेम सेल और crypt समारोह तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि अधिकांश organoid अध्ययन विट्रो परख में रोजगार, organoids भी विवो कार्यात्मक विश्लेषण में के लिए चूहों को दिया जा सकता है. इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण दवाओं के लिए चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए फायदेमंद हैं क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध उपचार आम तौर पर जीनोम बदलने के बजाय जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन समारोह नियमन द्वारा कार्य करते हैं.
Introduction
लंबे समय तक समय अवधि में छोटी आंतों या बृहदान्त्र से तीन आयामी (3 डी) organoids के रूप में माउस या मानव crypts कोशिकाओं संस्कृति की क्षमता एक बड़ी सफलता प्रदान की है क्योंकि इन संस्कृतियों विवो में आंतों उपकला की सुविधाओं को परिभाषित प्रदर्शन 1 , २ , 3. प्राथमिक crypts से व्युत्पन्न organoids स्वयं नवीकरण और आत्म संगठन के लिए सक्षम हैं, मूल के अपने ऊतकों के समान सेलुलर कार्यों का प्रदर्शन. वास्तव में, organoids न केवल विवो में crypts के संरचनात्मक संगठन recapitulate, लेकिन यह भी कई आणविक सुविधाओं, इस प्रकार सामान्य जीव विज्ञान और रोग राज्यों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान. उदाहरण के लिए, ऑर्गनॉइड अध्ययनों से पता चला है कि ऊतक पुनर्जनन1,2,3,4,5 के साथ-साथ ऐसी दवाएं जो कार्य को बढ़ा सकती हैं, में शामिल उपन्यास आण्विक मार्ग पैथोलॉजिकल सेटिंग्समें 6,7.
आंतों स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन विशेष रुचि का है क्योंकि आंतों की परत सबसे अधिक पुनर्योजी स्तनधारी ऊतकों में से एक है, खुद को हर 3-5 दिनों के नवीकरण बैक्टीरिया से जीव की रक्षा के लिए, विषाक्त पदार्थों, और अन्य रोगजनकों के भीतर आंत्र लुमेन्स. आंत्र स्टेम सेल (ISCs) इस उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता के लिए जिम्मेदार हैं और इस प्रकार वयस्क स्टेम सेल समारोह1,2के अध्ययन के लिए एक अद्वितीय प्रतिमान प्रदान करते हैं. चूहों में वंश-ट्रैकिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि अलग Lgr5 सकारात्मक स्टेम कोशिकाओं को 3 डी organoids या ‘मिनी गट’ इन विट्रो में उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, जहां वे बारीकी से अपने vivo समकक्षों में दर्पण. Organoid संस्कृतियों भी आंतों crypt सेल अलग से प्राप्त किया जा सकता है संतति के शामिल, ISCs, और Paneth कोशिकाओं, जिनमें से बाद विवो में उपकला आला कोशिकाओं का गठन. वास्तव में, प्राथमिक आंतों crypt कोशिकाओं से organoid संस्कृति एक अपेक्षाकृत नियमित तकनीक है कि व्यापक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग कर सबसे प्रयोगशालाओं में लागू करने के लिए आसान है में विकसित किया गया है. यह मॉडल आरएनए-सेक्सिंग (आरएनए-सेक) और प्रोटीन द्वारा द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या इम्यूनोफ्लोरेसेंटधुंधला 2,4,8द्वारा जीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए भी अनुकूल है। इसके अलावा, कार्यात्मक आनुवंशिकी लाभ के समारोह का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (जीन overexpression या एक सक्रिय उत्परिवर्ती जीन की अभिव्यक्ति) या हानि के समारोह (जीन silencing या एक हानि के समारोह उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति) दृष्टिकोण2.
महत्वपूर्ण बात, कम दक्षता और मानक प्लाज्मिड डीएनए या polybrene के साथ वायरल transduction प्रोटोकॉल के उच्च विषाक्तता क्षेत्र में एक बड़ी बाधा बनी हुई है. हालांकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देता है, इस दृष्टिकोण समय लेने वाली चयन अनुक्रम सत्यापन9के बाद की आवश्यकता है. यहाँ, हम प्राथमिक आंतों organoids कि चुंबकीय नैनोकणों और एक चुंबकीय क्षेत्र के आवेदन करने के लिए संयोजन द्वारा वायरल कणों के वितरण का अनुकूलन के लिए एक वायरल transduction प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पूर्व प्रोटोकॉल4,5,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण संशोधन और दक्षता बढ़ाने के लिए सिफारिशें प्रदान की जाती हैं . हम भी 3 डी matricgel में सुसंस्कृत बरकरार organoids से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन (इसलिए आगे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के साथ आगे विश्लेषण के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क आंतों उपकला की प्राथमिक संस्कृति organoids के रूप में स्टेम सेल समारोह में शामिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है , आंतों उपकला homeostasis , और विकृति1,2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), मैरीलैंड स्टेम सेल रिसर्च फंड (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), अमेरिकन लुंग एसोसिएशन, Allegheny स्वास्थ्य नेटवर्क से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था हॉपकिंस रिसर्च फंड और हॉपकिंस पाचन रोग बुनियादी अनुसंधान कोर केंद्र.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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