Genetisk engineering av primær mus intestinal Organoids bruke magnetisk Nanopartikkel Transduction viral vektorer for frossen snitting
Summary
Vi beskriver trinnvise instruksjoner til: 1) effektivt ingeniør intestinal organoids ved hjelp av magnetiske nanopartikler for Lenti-eller retroviral Transduction, og, 2) generere frosne seksjoner fra konstruert organoids. Denne tilnærmingen gir et kraftig verktøy for å effektivt endre genuttrykk i organoids for etterforskning av nedstrøms effekter.
Abstract
Intestinal organoid kulturer gir en unik mulighet til å undersøke intestinal stilk cellen og krypten biologi in vitro, men effektive tilnærminger til å manipulere genuttrykk i organoids har gjort begrenset fremgang i denne arenaen. Mens CRISPR/Cas9 teknologi gjør det mulig for presis Genova redigering av celler for organoid generasjon, denne strategien krever omfattende utvalg og screening av sekvens analyse, som er både tidkrevende og kostbart. Her gir vi en detaljert protokoll for effektiv viral Transduction av intestinal organoids. Denne tilnærmingen er rask og svært effektiv, og dermed redusere tid og kostnader iboende i CRISPR/Cas9 teknologi. Vi presenterer også en protokoll for å generere frosne seksjoner fra intakte organoid kulturer for videre analyse med immunhistokjemiske eller immunofluorescent farging, som kan brukes til å bekrefte genuttrykk eller stanse. Etter vellykket Transduction av viral vektorer for genuttrykk eller deaktivering er oppnådd, intestinal stilk cellen og krypten funksjonen kan raskt vurderes. Selv om de fleste organoid studiene benytter in vitro-analyser, kan organoids også leveres til mus for in vivo funksjonell analyse. Videre er våre tilnærminger fordelaktig for å forutsi terapeutiske reaksjoner på narkotika fordi tiden tilgjengelig behandling generelt funksjon av modulerende genuttrykk eller protein funksjon snarere enn å endre det Genova.
Introduction
Evnen å kulturen musen eller Human Krypter celler idet tredimensjonal (3D) organoids fra det liten tarmen eller kolon over lengre tid perioder forsynt en større gjennombruddet fordi disse kulturen utfoldelse definerende vise egenskaper av intestinal epitel inne vivo 1 den andre , 2 andre priser , 3. Organoids avledet fra primære Krypter er i stand til selv-fornyelse og selv-organisasjon, viser cellulære funksjoner som ligner på deres vev opprinnelse. Faktisk, organoids recapitulate ikke bare den strukturelle organiseringen av Krypter in vivo, men også mange molekylære funksjoner, og dermed gi nyttige verktøy for å studere normal biologi og sykdom tilstander. For å illustrere, har organoid studier avdekket romanen molekylære trasé involvert i vev gjenfødelse1,2,3,4,5 samt medikamenter som kan forbedre funksjon i patologisk innstillinger6,7.
Studiet av tarm stamceller er av spesiell interesse fordi intestinal fôr er blant de mest regenererende pattedyr vev, fornye seg hver 3-5 dager for å beskytte organismen fra bakterier, toksiner og andre patogener i tarm lumen. Intestinal stamceller (ISCs) er ansvarlig for denne bemerkelsesverdige regenererende evne og dermed gi et unikt paradigme for å studere voksen stilk cellen funksjon1,2. Lineage-tracing eksperimenter i mus demonstrerte at isolerte Lgr5-positive stamceller kan bli kultivert å generere 3D-organoids eller “mini-guts” in vitro der de tett speile sine in vivo kolleger. Organoid kulturer kan også være avledet fra intestinal krypten celle isolerer består av forfedre, ISCs, og Paneth celler, sistnevnte som utgjør epitel nisje celler i vivo. Faktisk har organoid kultur fra primære intestinal krypten celler utviklet seg til en relativt rutinemessig teknikk som er lett å implementere i de fleste laboratorier ved hjelp av allment tilgjengelige reagenser. Denne modellen er også mottagelig for kvantitativ analyse av genuttrykk av RNA-sekvensering (RNA-SEQ) og proteiner av masse massespektrometri, immunhistokjemi, eller immunofluorescent farging2,4,8. I tillegg kan funksjonell genetikk bli studert ved hjelp av gevinst-av-funksjon (Gen overuttrykte eller uttrykk for et aktiverings mutant gen) eller taps-av-funksjon (Gen-deaktivering eller uttrykk for en tap-of-Function-mutant) tilnærminger2.
Viktigere, lav effektivitet og høy toksisitet av standard plasmider DNA eller viral Transduction protokoller med polybrene fortsatt et stort hinder i feltet. Selv om CRISPR/Cas9-teknologien gjør det mulig for presise Genova redigering, krever denne tilnærmingen tidkrevende valg etterfulgt av sekvens validering9. Her presenterer vi en viral Transduction protokoll for primære intestinal organoids som optimaliserer levering av virale partikler ved Bøyning til magnetiske nanopartikler og anvendelse av et magnetisk felt. Viktige endringer i tidligere protokoller4,5,10,11,12,13 og anbefalinger for å forbedre effektiviteten er gitt. Vi beskriver også en tilnærming for å generere frosne seksjoner fra intakt organoids kultivert i 3D-matrigel (heretter referert til som kjeller membran matrise eller matrise) for videre analyse med immunhistokjemi eller immunofluorescent farging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primær kultur av voksen intestinal epitel som organoids gir et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer involvert i Stamcelle funksjon, intestinal epitel homeostase, og patologi1,2,3, firetil. Selv om CRISPR/Cas9-teknologi kan brukes til genetisk ingeniør organoids9, er det begrenset av behovet for omfattende screening og valg basert på sekvens analyse …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), den amerikanske lunge foreningen, The Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund og Hopkins fordøyelsessykdommer Basic Research Core Center.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
