Genteknologi af primære mus intestinale Organoider ved hjælp af magnetisk nanopartikel Transduktionsvirale vektorer for frosne skæring
Summary
Vi beskriver trin-for-trin instruktioner til: 1) effektivt ingeniør tarm organoider ved hjælp af magnetiske nanopartikler til Lenti-eller antiretroviral transduktion, og, 2) generere frosne sektioner fra manipuleret organoider. Denne fremgangsmåde giver et effektivt værktøj til effektiv ændring af genekspression i organoider til undersøgelse af downstream-effekter.
Abstract
Tarm organoid kulturer giver en enestående mulighed for at undersøge tarm stamcelle og Crypt biologi in vitro, selv om effektive tilgange til at manipulere genekspression i organoider har gjort begrænsede fremskridt i denne arena. Mens CRISPR/Cas9-teknologien giver mulighed for præcis genomredigering af celler til organoid-generering, kræver denne strategi omfattende udvælgelse og screening ved Sekvensanalyse, hvilket både er tidskrævende og dyrt. Her giver vi en detaljeret protokol til effektiv viral transduktion af intestinale organoider. Denne fremgangsmåde er hurtig og yderst effektiv og mindsker dermed den tid og omkostning, der er forbundet med CRISPR/Cas9-teknologien. Vi præsenterer også en protokol til at generere frosne sektioner fra intakt organoid kulturer til yderligere analyse med immunohistokemiske eller immunfluorescent farvning, som kan bruges til at bekræfte genekspression eller hæmning. Efter vellykket transduktion af virale vektorer for genekspression eller lyddæmpningen opnås, kan tarm stamcelle og Crypt funktion hurtigt vurderes. Selv om de fleste organoid-studier anvender in vitro-assays, kan organoider også leveres til mus til in vivo funktionelle analyser. Desuden er vores tilgange er fordelagtige for at forudsige terapeutiske reaktioner på narkotika, fordi øjeblikket tilgængelige behandlinger generelt fungerer ved at modulerende genekspression eller protein funktion i stedet for at ændre genomet.
Introduction
Evnen til at kultur mus eller menneskelige Krypter celler som tredimensionale (3D) organoider fra små tarme eller kolon over langvarige perioder forudsat et stort gennembrud, fordi disse kulturer viser definerende funktioner i tarm epitelet in vivo 1 , 2 , 3. organoider afledt af primære Krypter er i stand til selvfornyelse og selvorganisering, udstiller cellulære funktioner svarende til deres væv af oprindelse. Faktisk, organoider rekapitulere ikke kun den strukturelle organisation af Krypter in vivo, men også mange molekylære træk, hvilket giver nyttige værktøjer til at studere normale biologi og sygdomstilstande. For at illustrere, organoid undersøgelser har afsløret nye molekylære veje involveret i vævsregeneration1,2,3,4,5 samt lægemidler, der kan forbedre funktionen i patologiske indstillinger6,7.
Studiet af tarm stamceller er af særlig interesse, fordi tarmslimhinden er blandt de mest regenerativ pattedyrs væv, forny sig hver 3-5 dage for at beskytte organismen mod bakterier, toksiner og andre patogener inden for tarm lumen. Tarm stamceller (ISCs) er ansvarlige for denne bemærkelsesværdige regenerativ kapacitet og dermed give et unikt paradigme for at studere voksen stamcelle funktion1,2. Lineage-Tracing eksperimenter i mus viste, at isolerede Lgr5-positive stamceller kan dyrkes for at generere 3D-organoider eller ‘ mini-Guts ‘ in vitro, hvor de nøje afspejler deres in vivo-modparter. Organoide kulturer kan også udledes af intestinal Crypt celle isolater bestående af stamceller, Isc’er og Paneth cellerne, hvoraf sidstnævnte udgør epitelial niche celler in vivo. Faktisk har organoid kultur fra primære intestinale Crypt-celler udviklet sig til en relativt rutinemæssig teknik, der er let at implementere i de fleste laboratorier ved hjælp af alment tilgængelige reagenser. Denne model er også modtagelig for kvantitativ analyse af genekspression ved RNA-sekventering (RNA-SEQ) og proteiner ved massespektrometri, immunhistokemi eller immunfluorescent farvning2,4,8. Desuden kan funktionel genetik undersøgt ved hjælp af Gain-of-funktion (gen overekspression eller udtryk for et aktiverende mutant gen) eller tab af funktion (genhæmning eller udtryk af en tab-of-Function mutant) tilgange2.
Vigtigere, lav effektivitet og høj toksicitet af standard plasmid DNA eller viral transduktionsprotokoller med polybrene forbliver en stor forhindring i marken. Selvom crispr/Cas9-teknologien giver mulighed for præcis genom-redigering, kræver denne fremgangsmåde tidskrævende valg efterfulgt af sekvens validering9. Her præsenterer vi en viral transduktionsprotokol for primære intestinale organoider, der optimerer leveringen af virale partikler ved konjugering til magnetiske nanopartikler og anvendelse af et magnetfelt. Der gives vigtige ændringer af tidligere protokoller4,5,10,11,12,13 og anbefalinger til forbedring af effektiviteten. Vi beskriver også en tilgang til at generere frosne sektioner fra intakte organoider dyrket i 3D matrigel (fremover benævnt kælder membran matrix eller matrix) til yderligere analyse med Immunhistokemi eller immunfluorescent farvning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primær kultur af voksne tarm epitelet som organoider giver et kraftfuldt værktøj til at studere molekylære mekanismer involveret i stamcelle funktion, intestinal epitelial homøostase, og patologi1,2,3, 4. Selv om CRISPR/Cas9 teknologi kan bruges til genetisk ingeniør organoids9, er det begrænset af behovet for omfattende screening og udvælgelse baseret på Sekve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland stamcelleforskning fond (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American Lung Association, den Allegheny Health Network-Johns Hopkins forskningsfond og Hopkins fordøjelsessygdomme grundlæggende forskning kerne Center.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
