I lys av 3Rs prinsipp, er åndedretts modeller som alternativer til dyrestudier utvikling. Spesielt for risikovurdering av respiratoriske stoffer er det mangel på passende analyser. Her beskriver vi bruk av menneskelige presisjonsstyrte kutte lunge skiver for vurdering av luftbåren stoffer.
Luftveissykdommer i deres brede mangfoldet må riktig modellsystemer å forstå de underliggende mekanismene og utvikling av nye therapeutics. I tillegg krever registrering av nye stoffer riktig risikovurdering med tilstrekkelig testing systemer å unngå risikoen for enkeltpersoner å bli skadet, for eksempel i arbeidsmiljøet. Slike risikovurderinger utføres vanligvis i dyrestudier. I lys av 3Rs prinsipp og offentlige skepsis mot dyreforsøk, har human alternative metoder, for eksempel presisjonsstyrte kutte lunge skiver (PCLS), utviklet. Utredningen beskriver ex vivo teknikken av menneskelig PCLS å studere immunmodulerende potensialet av lav-molekylvekt stoffer, som ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Målt endepunktene inkluderer levedyktighet og lokale åndedretts betennelse, preget av endrede sekresjon av cytokiner og chemokines. Pro-inflammatoriske cytokiner, tumor nekrose faktor (TNF-α) alfa og interleukin 1 alpha (IL-1α) var betydelig økt i menneskelig PCLS etter eksponering for en sub giftige konsentrasjon av HClPt. Selv om teknikken av PCLS er vesentlig optimalisert de siste tiårene, er brukbarheten for testing av immunomodulation fortsatt i utvikling. Derfor er resultatene som presenteres her foreløpige, selv om de viser potensialet i menneskelige PCLS som et verdifullt verktøy i luftveiene forskning.
Luftveissykdommer som allergisk astma, yrkesmessig astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), emfysem og infeksjoner i øvre og nedre luftveiene er på vei og et verdensomspennende helse byrden1,2. Egnet testsystemer er nødvendig, for å identifisere noen av de grunnleggende mekanismene underliggende disse sykdommer, i tillegg til utvikling og testing av riktig stoffer. Grunnforskning samt prekliniske narkotika utvikling er fokusert på resultater i i vitro eller vivo analyser. Disse analyser, men har sine begrensninger3. Først i vitro analyser utnytte menneskeceller som ble isolert og fjernet fra tilstøtende vev eller organer og er dermed ikke lenger kunne samhandle med eller beskyttes av andre celler3. Dernest er dyremodeller ofte ikke oversettbare til mennesker på grunn av forskjeller i fysiologi og biokjemiske forskjeller4. For å minimere disse begrensningene, og i sammenheng med 3Rs (erstatning, raffinement, reduksjon) prinsippet5, nye alternative modeller stadig utvikling.
Alternative menneskelig vev 3D modeller, for eksempel PCLS, er en kobling mellom menneske-baserte i vitro og komplekse dyr i vivo modeller. PCLS gjenspeiler den funksjonelle heterogenitet med alle aktuelle celletyper tilstede i luftveiene6. I tillegg har PCLS teknikken fordelen av reproduserbar utarbeidelse av flere tynne skiver av presise tykkelse fra en enkelt dyr eller human vev donor. Dette tillater en intern kontroll samt ulike konsentrasjoner eller narkotika testes.
Siden første introduksjonen av agar fylt menneskelige lunge skiver i 1994 av Fisher et al. 7 teknikken for kutting og dyrking av lungevev er betydelig forbedret. Christian Martin et al. har forbedret denne teknikken for videre kjemiske og farmakologiske søknader8. Vår gruppe ble introdusert til denne teknikken av Christian Martin i 2007. Siden da har anvendelse av PCLS i forskning utvidet fra testing av funksjonelle svar, for eksempel luftveiene9,10 og vasokonstriksjon11, til immunologiske, farmakologiske12,13, og toksikologiske7 testing i ulike arter i flere laboratorier. For eksempel Schlepütz et al. 14 undersøkt airway svar for arter forskjeller og sammenlignet perifere Nevron aktivisering av elektriske feltet stimulering (EFS) eller av capsaicin i mus, rotter, marsvin, sauer, silkeaper og mennesker. De ulike artene har atskilte, men ulike mønstre av nerve-mediert bronchoconstriction og konkluderte med at de brukte forsøksdyr (mus og rotter) ikke alltid gjenspeiler menneskelige reaksjoner. For testing av lungene-toksisitet og redusere antall dyr i denne sammenheng, Hess et al. 15 pre godkjent rotte PCLS som et ex vivo alternativ for innånding toksisitet studier. Denne multicentric før validering studien resulterte i utviklingen av to prediksjon modeller PCLS med lovende resultater.
Videre i grunnleggende forskning, har PCLS blitt brukt til å belyse kalsium signalering16og tidlig allergiske reaksjoner17virusinfeksjon svar18,19. Tekniske fremskritt er pågående ytterligere fremskritt blir undersøkt. For eksempel øker feltet fordelen av menneskelig vev ved lagring og gjenbruk av frossent. Rosner et al. beskrevet teknikk fryses murine PCLS som bevarer evne til luftveiene kontrakt ved stimulering: derfor teknikken forlenger vinduet tidsbegrenset som vev være levedyktig, og så videre Analyser kan brukes over tid de samme donor20. I tillegg til disse forskning fremskritt, Lauenstein et al. 21 nylig undersøkt risikovurdering av ulike kjemikalier som kan fungere som potensielle allergifremkallende stoffer for yrkesmessig astma i menneskelig PCLS.
Yrkesmessig astma, som har symptomer er luftveisobstruksjon og luftveier hyperresponsiveness, ligner på allergisk astma, er indusert av eksponering for høy-molekylvekt (HMW)22 eller lav-molekylvekt (LMW) stoffer23 (f.eks , platina forbindelser) i arbeidsmiljø. LMW har en høy sensibilisering potensielle når danner kan og binde til carrier proteiner21. Registrering av nye HMW eller LMW kjemikalier krever i vitro og i vivo risikovurdering om deres antatte sensibilisering potensielle (f.eks., OECD retningslinje 429)24. Tester til å bestemme den antatte sensibilisering potensial, men var ikke konstruert for risikovurdering av respiratoriske allergifremkallende stoffer, men for kontakt allergifremkallende stoffer, men det syntes å være noen kongruens for en undergruppe av stoffer25 . Arbeidet Lauenstein et al. var utformet som en del av EU prosjektet Sens-it-iv å utvikle alternative testing strategier for risikovurdering av antatte kontakt eller lunge allergifremkallende stoffer21. For dette prosjektet fokuserte vi på teste brukbarheten av menneskelige PCLS som et testing verktøy. Derfor ble en rekke immunmodulerende endepunkt (f.eks, levedyktighet og cytokin sekresjon) valgt til irriterende eller inflammatorisk potensialet i kjemikalier, som LMW platinum forbindelser. Lauenstein et al. funnet noen generelle mønsteret som kan brukes på alle åndedretts allergifremkallende stoffer; men gitt arbeidet grunnlaget for nylig publisert protokoller26.
Oppsummert gir protokollen presenteres her for forberedelser og etterfølgende eksponering av menneskelig PCLS en nyttig metode for evaluering av potensielt lunge-giftig og/eller immunmodulerende stoffer som kan være involvert i utviklingen av luftveiene sykdommer, for eksempel yrkesastma.
Menneskelige PCLS teknikken er godt etablert i vårt laboratorium. Utredningen gir en beskrivelse av denne teknikken og bruken for toksisitet testing av stoffer i lunge vev ex vivo. Generelt relaterte noen laboratorium bruker denne teknikken bør søke å sette opp en analysen definisjonen av kvantifiserbare områder, estimering av variabilities og kvalitetskontroll garanterer gyldigheten av eksperimentet. Mulig standard prosedyrer kan være, for eksempel Gjenta hvert sluttpunkt, f.ekscytotoksisitet analysen, i minst tre biologiske givere (personlige tekster) med et minimum av to til tre tekniske replikat per eksempel inkludert positiv og negativ referanser. Laboratoriepersonell bør trenes til å øke analysen konsistens og minimere analysen variasjon.
Endepunktene brukes ofte til å vurdere immunmodulerende effekter av stoffer på lungevev inkluderer cytotoksisitet mål med ulike analyser (f.eks, LDH analysen, WST-1 analysen, mikroskopiske flekker analysen), cytokin utgivelsen søk, så vel som endringer i profilen for expression og karakterisering av endringer i mobilnettet bestander av immunohistopathological metoder6. Videre finnes det teknikker som beskriver visualisering av celler, for eksempel lunge dendrittiske celler, i murine PCLS28 kan også overføres til menneskelig PCLS og kan dermed gi mer detaljert innblikk i mobilnettet sammensetningen før og etter behandling med antatte cytotoksiske stoffer.
Denne grunnleggende protokollen og teknikk for utarbeidelse av menneskelig lunge vev deler sammenlignes teknikker som har blitt beskrevet i publikasjoner29. Kort sagt, hentes orgel materialet fra pasienter som lider av live-truende kroniske sykdommer som lungekreft, som måtte opereres for resection eller transplantasjon. Studiene må godkjennes av den lokale etikk. Pasientenes informert skriftlig samtykke er nødvendig. Definere en arbeidsflyt mellom klinikk og laboratoriet er viktig og krever kommunikasjon og definisjon av grensesnitt og infrastruktur mellom begge områder. Menneskelige lunge materiale må behandles direkte etter eksisjon å bevare levedyktighet av vev. Det er verdt å nevne at teknikken beskrevet her for menneskelig PCLS kan brukes til både unge og gamle lungene og friske og syke lungene. I USA, for eksempel er det mulig å få lungene fra sunn orgel givere som døde i ulykker eller som organer er avvist for transplantasjon.
Det første kritiske trinnet i protokollen er inflasjonen airways og omkringliggende parenchyma med agarose løsning. Dette trinnet er nødvendig å størkne veldig bløtvev for påfølgende kutting prosedyren. Kvaliteten på menneskelig lunge materiale, basert på sykdom bakgrunnen, er kritiske her. Bare lobes med intakt pleura kan fylles. Sluttstadiet svulster i bronchus hindre noen ganger fylling prosessen. Før oppblåsing menneskelige materialet, må temperaturen på agarose løsningen kontrolleres grundig. For mye blod (eller andre væsker, eksudater) i menneskelige lungevev vil resultere i uønsket fortynning av agarose og vil påvirke polymerisasjon prosessen. Etter inflasjon av lungevev og gelling av agarose på is, er lungene kuttet i seksjoner av 200 til 300 µm tykkelse. Konsistensen av vev er svært viktig. Hvis vevet er for myk, er kutting av like deler vanskelig. Selv om de samme mikrotomen er angitt for hver giver, tykkelsen på sektorene mellom givere kan variere, grunn av personlige forhold og endringer under den blåse prosessen for hver lunge. Ikke-homogen fylling av vev vil resultere i forskjellige skive tykkelser. Istedet for måling og standardisere tykkelsen på skiver, kan måling av totale proteininnhold brukes til å overvåke indirekte lunge skive tykkelser. Flere sluttstadiet sykdommer hemme kutting prosessen; f.eksblod fartøy er ekstremt fortykket i pulmonal hypertensjon og fibrotiske vev kan være så stiv at kutting av vev sylindere er neppe mulig og mikrotomen bladet må skiftes ofte.
Etter forberedelse av menneskelig PCLS og intensiv vask trinn, som er nødvendig for å fjerne celle rusk og utgitt enzymer, vev inndelinger kan brukes for eksperimenter29. Menneskelig PCLS er kultivert under normal celle kultur forhold og utsatt, for eksempel for kjemikalier, narkotika eller lipopolysaccharides. Sporadiske forurensning av PCLS på grunn av (Ukjent) infeksjoner er en spesialutgave i kulturen i menneskelig lunge materiale. Vev kulturer viser infeksjoner må kastes og utstyret må desinfiseres grundig. Romlig skille mellom laboratorium steder brukes for utarbeidelse på den ene siden og dyrking kan derimot bidra til å unngå kryss-infeksjoner. Når det gjelder utstyr, mikrotomen kan lekke og hex skruer kan føre til motor skade og stoppe av blade bevegelse. Ikke alle deler av sliceren er laget av rustfritt stål, og så det vil oksidere hvis ikke tørket umiddelbart endre rengjøring. For å overvinne utstyr problemer, kan det være nødvendig å ha minst én sikkerhetskopieringsenhet.
I tidligere publikasjoner, er agarose rapportert å være vasket og fjernet under intensiv vask trinn etter klargjøring. Faktisk, denne er ikke mulig, agarose fjernes ikke. For fullstendig fjerning av agarose må det være re smeltet ved høye temperaturer, som vil ødelegge vev. Agarose i alveoler og airways forstyrrer ikke beskrevet endepunktene. Andre endepunktene kan bli påvirket av tilstedeværelsen av agarose (se også begrensninger). Behovet for å utarbeide veldig ferskt vev deler har understrekes, som vev levedyktighet er viktig i kultur. Bronchoconstriction er ikke en gyldig parameter for levedyktighet. Vi anbefaler å bruke minst to eller tre uavhengige cytotoksisitet analyser sjekke levedyktigheten til de omkringliggende parenchyma; Dette må sjekkes inn hvert eksperiment30. Kvalitetskontroll i cytotoksisitet analyser tjene som indikatorer på utilstrekkelig vev levedyktighet. Det anbefales derfor å vurdere responsen til vev, for eksempel til en effektiv giftig som et vaskemiddel i alle cytotoksisitet analyser. Basert på dose-respons kurver, laveste og høyeste verdi absorpsjon må defineres for cytotoksisitet analyser og møtte for etterfølgende eksperimenter. Ytterligere modifiseringer å protokollen avhenger hovedsakelig brukt kjemikalier og endepunktene på interesse. Anvendelse av uløselig eller svært reaktive kjemikalier er begrenset. Den høyeste løsemiddel konsentrasjonen for DMSO er begrenset til 1%. Høyere konsentrasjoner kan brukes, men kan resultere i markert utgivelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, slik som IL-8. På den annen side, kan stimulans brukes være relativt svake. I dette tilfellet kan du øke mengden vev fra to til fire skiver per brønn. Dette begrenser levedyktigheten til 24 h.
En stor begrensning av menneskelig PCLS er at i Tyskland de kan bare være forberedt fra syke mennesker lunge materiale. Pasienter som gjennomgår kirurgi er vanligvis eldre enn 50 år og 80% av pasienter som lider av lungekreft er eller pleide å være røykere. Medisinering av pasienter, som glukokortikoider, kan også påvirke utfallet av eksperimenter ved hjelp av menneskelig vev. Derfor er det viktig å: i) validere hvert eksperiment av positiv referanser bekrefter levedyktighet, funksjonalitet og følsomhet av personlige vev og ii) kryss-validere resultatene med sunn, ikke-syke, middelaldrende lungevev fra forsøksdyr (ikke-menneskelige primater som cynomolgus og, hvis mulig, mus, rotte, marsvin). Jo bedre patologi score av syke vev, jo bedre de eksperimentelle resultatene. Tungt syke vev kan neppe brukes og ofte viser begrenset levedyktighet, mangelfullt lav eller svært høy cytokin nivåer, bakterier og sopp infeksjoner og mindre bronchoconstriction. Giver-til-donor variant blir høyere sammenlignet med resultatene fra forsøksdyr, gjenspeiler personlige variasjon av mennesker. Dette er imidlertid ikke en begrensning. som nevnt ovenfor, i andre land (f.eks, USA) er det mulig å få sunn lungene fra avdøde orgel givere avvist for transplantasjon. Responsen til vevet har blitt godt beskrevet for den første opptil 48 timer i akutt eksponering eksperimenter. Levedyktighet og funksjonaliteten av vev reduseres etter mange dager med kultur eller lagring på-80 ° C. Det er mulig å kultur menneskelige lungevev for opp til ca 14 dager. Levedyktighet fortsetter samtidig; men er en økning i variasjon, samt tap av funksjonalitet for flere celle populasjoner, som makrofager, i vevet observert, som resulterer i begrenset cytokin utgivelsen svar mitogens. En annen begrensning for noen endepunkter er tilstedeværelsen av agarose vev, hindre, for eksempel isolering av høy kvalitet og tilstrekkelig mengder RNA31 eller utarbeidelse av encellede suspensjoner for etterfølgende flowcytometri og phenotyping celler. Muligheten til å få mekanistisk innsikt i én celle svar og funksjonaliteten er begrenset.
Organotypic vev modeller, som menneskelige PCLS, anses å ha en høy effekt på grunnleggende og ikke-klinisk forskning. Menneskelige lunge materiale har en biologisk sammensetning som tett gjenspeiler vanlige orgel arkitektur. Den inneholder for eksempel bolig alveolar og bronkial epitelceller, glatte muskelcellene, fibroblaster, endotelceller, nerve fiber og makrofager. Vevet er levedyktig cellene reagerer flere stimuli. Nerve fibre, selv om kuttet, kan lokalt aktiveres, fører til terminal refleks svar14. Derfor tilbyr denne ex vivo modellen muligheten til å studere mobilnettet medfødte immunreaksjoner, forsvar svar, cytokin signalering og induksjon av cellen overflate markører. Flere forbedringer i teknikk, dyrking og validering av endepunktene tillate bruk av menneskelige PCLS i translasjonsforskning vitenskap. Eksempler på fremtidige tilnærminger: i) validering av nye mål i menneskelig lungevev, ii) vurdering av immunreaksjoner etter eksponering, for eksempel kjemikalier, narkotika, nanopartikler, etc., iii) tilskudd av lungevev med immunceller, slik som T-lymfocytter, iv) identifikasjon og endring av molekylær mønster, for eksempel etter eksponering for åndedretts allergifremkallende stoffer, sykdom-inducing stoffer eller aktive forbindelser hemme baner; Videre v) airway ombygging og vi) neuronal regulering32. Det vitenskapelige feltet er interessert i disse nåværende og fremtidige tilnærminger med PCLS. I tillegg finnes det en rekke ulike utviklingstrekk som vil bidra til å forbedre PCLS teknikken, som cryo-bevaring20og vev strekker33 å etterligne den naturlige bevegelsen av vev under puste eller mekanisk ventilasjon.
Hovedfordelen med menneskelige PCLS sammenlignet med andre 3D-modeller er tilstedeværelsen av immunceller og nerve fibre. Eksperimenter kan også utføres i mus, rotte og ikke-menneskelige primater, som er dyrearter som fortsatt brukes oftest i farmakologi og toksikologi. Kompleksiteten i menneskelig lungevev støtter oversettelsen av resultater fra dyr til menneske og i vitro de vivo. I forbindelse med eksisterende alternativ analyser for identifikasjon av respiratoriske allergifremkallende stoffer, menneskelig PCLS er svært komplekse og tillater ikke innsikt i én celle svar. Likevel, mikroskopi og flyt cytometri kan gi informasjon om mobilnettet svar, hvis høyre mobilnettet markøren brukes i kombinasjon, for eksempel med apoptose, nekrose eller intracellulær markører. Det er publisert analyser som er godkjent og rapportert å ha vært brukt til å identifisere åndedretts allergifremkallende stoffer. Men er fremskritt i bruk av PCLS med alle sine fordeler over encellede analyser å bidra i den forstand at teknikken kan bli brukt for høy gjennomstrømming screening, som beskrevet av Watson et al. 34 de utviklet en høy gjennomstrømming screening analysen å forutsi airway toksisitet i murine cryo bevarte PCLS. Med miniatyriserte 96-brønnen PCLS format oppdaget de lignende readouts i murine lavage væske, gjør PCLS en mulig høy gjennomstrømming analysen.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Lan Lauenstein for sitt pre arbeid om alternative testing strategier for risikovurdering med menneskelige PCLS. Noen av forskningen ble støttet av et stipend fra Europakommisjonen i 6th framework programmet SENS-IT-IV “Romanen Testing strategier for In Vitro vurdering av allergener”.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |