マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル
Summary
この島分離プロトコルは、外分泌組織を消化するコラゲナーゼ注射の新しい経路と、マウスから島を精製するための簡略化された勾配手順を説明した。これは、酵素消化、勾配分離/精製、およびアイレット手摘みを含みます。分離に成功すると、マウスあたり250~350の高品質で完全に機能する島が生じます。
Abstract
膵島はランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターである。この島は主に5種類のホルモン分泌細胞から成っている:α細胞分泌グルカゴン、β細胞分泌インスリン、δ細胞分泌ソマトスタチン、ε細胞分泌グレリン、およびPP細胞は膵臓ポリペプチドを分泌する。島内の細胞の60~80%はβ細胞であり、インスリン分泌を研究する最も重要な細胞集団である。膵島は、排外インスリン分泌を研究するための重要なモデルシステムです。高品質の島を取得することは、糖尿病の研究のために非常に重要です。ほとんどのイヌレット分離手順は、コラゲナーゼ注射、過酷で複雑な消化手順、および多重密度勾配精製ステップの部位へのアクセスを技術的に困難にする必要があります。本論文では、詳細な説明と現実的なデモンストレーションを用いて、単純な高収量マウス島分離法を特徴とし、以下の具体的な手順を示す:1)ヴァーターのアンプルでのコラゲナーゼPの注入、膵管に接合する小さな領域と一般的な胆管、2)外分泌膵臓の酵素消化および機械的分離、および3)単一の勾配精製工程。この方法の利点は、Vaterのよりアクセスしやすいアンプルを使用した消化酵素の注入、酵素と機械的アプローチの組み合わせを使用したより完全な消化、およびより単純な単一勾配精製ステップです。このプロトコルは、マウスあたり約 250 ~ 350 の島を生成します。そして島は様々な生体内研究に適している。この手順の可能な注意点は、酵素消化および/または長時間の勾配インキュベーションによる潜在的に損傷した島であり、そのすべては、インキュベーション時間の慎重な広告正当化によって大きく回避することができる。
Introduction
膵島の単離のための文献には2つの一般的な方法があります。一つは、膵臓を切除し、外科ハサミを使用して小さな部分にそれをダイシングし、その後、コラゲナーゼ溶液1、2、3でそれを消化する必要があります。もう一つのより正確な方法は、消化酵素を導入するために膵臓に存在するダクトのネットワークを使用することです。以下の部位は、消化酵素注射に使用されている:胆汁と嚢胞性ダクトの接点、一般的な胆管への胆嚢、または一般的な胆管自体1、4、5。膵島は膵臓に均等に分布しないことが知られています。脾臓領域は、最も島6が含まれています。消化酵素を送達するために解剖学的経路を使用する第2の方法は、脾臓領域を含む膵臓のより完全な灌流を可能にするが、この手順は、多くの場合、技術的にであるVaterのアンプルのクランプまたは縫合を必要とする挑戦。島の精製に関しては、複数の密度勾配、ならびに細胞ストレーナーおよび磁気引き込みが島3、7を浄化するために使用されてきた。これらのグラデーションの使用は時間がかかる可能性があり、Ficollグラデーションは島8の有毒な損傷をもたらす可能性があります。
現在のプロトコルは、Li et al.7によって記述された方法に基づいて構築され、自分自身および他の1,4の経験に基づいて追加の変更が追加されます。私たちのプロトコルの最も重要なステップは、肝臓の端近くの一般的な胆管のクランプ、外分泌組織を消化するためにVaterのアンプルを介してコラゲナーゼPを注入し、その後、機械的に消化を促進するために振る水浴を使用しています1, 4,7.その後、’STOP’溶液は、島のさらなる消化を阻害するために適用されます。HBSSは、残りのコラゲナーゼPおよびSTOP溶液を洗い流すために使用される。Ficoll法を用いてヒトの島を精製した場合、収量はPercoll勾配9の使用と比較して、より大きな機能能を有する島(例えば、インスリン分泌)の2倍であると報告された。しかし、研究は、島1、10に対するその毒性効果のためにフィコル勾配の使用に疑問を持っています。ヒストパク勾配は、マウス島の単離に最適な精製運動を提供し、より簡単なステップと低コストの高品質の島の良好な収率を生み出すと報告されています。我々のプロトコルでは、ヒストパク-1077は、他の残留組織8、11から島を浄化するために使用される。収穫された島は、完全なRPMI-1640培養で培養することも、RNA/タンパク質定量で直接利用することも可能です。
我々のプロトコルは、コラゲナーゼP消化と単一の勾配精製ステップの組み合わせを使用して、他の公開されたプロトコルよりも簡単です。私たちの方法は、厳しい外科的処置を必要とせず、わずか数回の簡単な手順を持っています。さらに重要なことに、このプロトコルは、12を報告したように、一貫して高品質の機能島(250-350/マウス)の良好な収率を生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、コラーゲナーゼ灌流および消化を含み、続いて島の精製を行う。このプロトコルの最も重要なステップは、効果的な注入と膵臓1、4、7の完全な灌流です。このプロトコルの送達方法は、酵素が解剖学的経路を横断して、島1を取り巻く外分泌組織をより良く消化することを可能にする?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ジェニファー・ムンギアさんが回路図の芸術的なイラストを見てくださったことに非常に感謝しています。ヒューストンのコミュニティ公共ラジオ局KPFTのマイケル・R・ホニッグ氏の編集支援に感謝します。この研究は、米国糖尿病学会#1-15-BS-177(YS)、およびNIH R56DK118334/R01DK118334(YS)によって支持された。この研究はまた、USDA国立食糧農業研究所、ハッチプロジェクト1010840(YS)とR01 DK095118(SG)によってサポートされました。
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Referências
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