Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1
Summary
Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.
Abstract
Zika, dengue en chikungunya virussen worden overgebracht door muggen, ziekten met soortgelijke patiënt symptomen veroorzaken. Echter ze hebben verschillende downstream patiënt-te-patiënt transmissie mogelijkheden, en vereisen zeer verschillende behandelingen van de patiënten. Dus, recente Zika uitbraken maken het dringend noodzakelijk dat het ontwikkelen van hulpmiddelen die deze virussen bij patiënten snel te discrimineren en gevangen muggen, selecteert u de juiste behandeling van de patiënt, en te begrijpen en beheren van hun epidemiologie in real-time.
Helaas, huidige diagnostische tests, met inbegrip van die ontvangende 2016 noodsituatie gebruik vergunningen en fast track status, detecteren virale RNA door omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), waarvoor instrumentatie, opgeleid gebruikers, en bereiding van de grote monsters. Aldus, moeten zij worden verzonden naar “goedgekeurde” referentielaboratoria, waarvoor van tijd. Inderdaad, in augustus 2016, het Center for Disease Control (CDC) vroeg zwangere vrouwen die was gebeten door een mug en een uitslag Zika-vermelding een onaanvaardbaar 2 tot 4 weken vóór leren wachten of ze besmet werden ontwikkeld. We moeten heel veel tests die kunnen worden gedaan op de site, met weinig middelen en door opgeleide maar niet noodzakelijkerwijs gelicentieerde personeel.
Deze video toont een bepaling dat voldoet aan deze specificaties, met urine of serum (voor patiënten) of geplette muggen karkassen (voor milieu bewaking), werkt alles zonder veel bereiding van de monsters. Mosquito karkassen worden vastgelegd op papier uitvoering quaternaire ammoniumzouten groepen (Q-papier) gevolgd door ammoniak behandeling voor het beheer van gevaren. Deze zijn vervolgens rechtstreeks, zonder RNA isolatie, gestoken assay buizen met gevriesdroogde reagentia moeten geen ketting van koeling. Een gewijzigde vorm van omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte fluorescently tagged verschuifbare sondes produceert uitlezing, in 30 min, als een signaal van de drie kleuren fluorescentie. Dit wordt gevisualiseerd met een handheld, batterij-aangedreven apparaat met een oranje filter. Voorwaartse besmetting is met verzegelde buizen, en het gebruik van thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in aanwezigheid van dUTP in het mengsel versterking verhinderd.
Introduction
Muggen overgebrachte virusinfecties, met inbegrip van Zika-virus, dengue en chikungunya zijn op de opkomst en vraag onmiddellijk beheersstrategieën. Dengue en chikungunya virussen zijn al endemisch in veel van de tropische gebieden waar Zika nu in het westelijk halfrond1zich verspreidt. Zika virus, zoals dengue, deel uitmaakt van de Flavivirus -familie en is inheems in Afrika met een Aziatische en twee Afrikaanse genetische lineages2. Hoewel de identificatie van de Zika-virus uit 1947 dateert, bleef Zika infectie bij de mens sporadische voor een halve eeuw vóór de opkomst in de Stille Oceaan en Amerika. De eerste gemelde uitbraak van Zika koorts vond plaats op het eiland Yap in de Federale Staten van Micronesia in 2007, gevolgd door Frans-Polynesië in 2013 en 2014. De eerste grote uitbraak in Amerika vond plaats in 2015 in Brazilië.
Zika, dengue en chikungunya virussen zijn vooral overgedragen door Aedes aegypti pt Aedes albopictus. Zika heeft echter extra downstream mens-tot-mens transmissie mogelijkheden, waarschijnlijk wordt verspreid via seksueel contact, moeder-naar-foetus interactie, en via de borstvoeding3,4,5. Zika koorts werd voor het eerst geloofde alleen milde ziekte veroorzaken. Het was echter later Guillain-Barré syndroom bij volwassenen, microcefalie in pasgeborenen en chronische spier-en ziekten die laatste maanden tot jaren kunnen zijn gekoppeld. Diagnose van Zika ziekte kan lastig zijn, omdat de symptomen van een infectie Zika vergelijkbaar met die van andere mug-spread virussen6 zijn. Voorkomende co-infecties van deze virussen maken differentiële diagnose nog grotere uitdaging7,8. Snelle en betrouwbare detectie van de nucleïnezuren van Zika en andere virussen is daarom nodig om te begrijpen van de epidemiologie in real-time, bij het starten van de controle- en preventiemaatregelen, en het beheren van patiëntenzorg9.
Huidige diagnostische tests voor deze virussen omvatten serologische tests, isolatie van het virus, virus sequencing en omgekeerde-transcriptie PCR (RT-PCR). Standaard serologische benaderingen vaak lijden aan ontoereikende gevoeligheid en resultaten kunnen worden bemoeilijkt door Kruisallergie bij patiënten die eerder zijn door andere flavivirussen besmet.
Nucleïnezuur testen blijft daarom de meest betrouwbare manier om te ontdekken en te onderscheiden van deze virussen. Detectie van Zika en andere door muggen overgebrachte virussen wordt meestal uitgevoerd met behulp van de RT-PCR of RT-PCR in real time in verscheidenheid van biologische vloeistoffen, zoals serum, urine, speeksel, sperma, moedermelk en cerebrale vloeistof10,11. Urine en speeksel monsters zijn over het algemeen de voorkeur over bloed, omdat zij vertonen minder PCR-inhibitie, hogere virale belasting, virus aanwezigheid voor langere tijd, en het verhoogde gebruiksgemak verzamelen en verwerken van12,,13. RT-PCR-gebaseerde diagnostische tests, bestaat echter uit uitgebreide steekproef voorbereiding stappen en dure thermische fietsen apparatuur, waardoor het minder optimaal voor de point-of-care.
Omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) heeft ontpopt als een krachtige RT-PCR alternatief vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit14, zijn tolerantie voor remmende stoffen in biologische monsters15, en werking op interne temperatuur, die aanzienlijk verlaagt assay complexiteit en bijkomende kosten, waardoor het geschikt is voor omgevingen met lage resource. RT-LAMP, omvat zoals het klassiek wordt uitgevoerd, zes inleidingen die zich aan acht verschillende regio’s binnen het doeldocument RNA binden. Het draait bij een constante temperatuur tussen 60 ° C en 70 ° C, en gebruikt een reverse-transcriptase en een polymerase van DNA met sterke strand verdringt activiteit.
Tijdens de eerste stadia van de RT-LAMP vormen voorwaartse en achterwaartse interne inleidingen (FIP en BIP, figuur 1A) samen met de buitenste voorwaartse en achterwaartse inleidingen (F3 en B3) een halter-structuur, de zaad-structuur van de exponentiële versterking van de LAMP. Versterking verder wordt versneld door de lus voorwaartse en achterwaartse inleidingen (LF en LB), die zijn ontworpen om het binden van de enkele gestrande regio’s van de halter, en resulteert in de vorming van concatemers met meerdere herhalende lussen16. Klassieke LAMP testen op basis van troebelheid of uitlezing door DNA intercalating kleurstoffen is niet geheel geschikt voor point-of-care detectie van Zika, waar sommige multiplexing is gewenst17,18,19. Multiplex is niet gemakkelijk verkregen in deze systemen, zoals ze gevoelig zijn voor het genereren van vals-positieven te wijten aan uit-target amplifications.
Voor het beheren van deze kwesties, wordt extra materiaal in de vorm van een “deel-verdringt probe” in de literatuur toegevoegd aan de klassieke RT-LAMP het platform20,21,22. Elke sonde heeft een reeks specifieke dubbele-strand en een single-stranded priming-regio. De sonde met de single-stranded regio is gelabeld met een 5′-fluorophore, en de aanvullende sonde wordt gewijzigd met een quencher van 3′-eind. Bij gebrek aan een doel, wordt geen fluorescentie waargenomen als gevolg van de kruising van de strengen van complementaire sonde, waardoor de fluorophore en de quencher in de nabijheid. In aanwezigheid van een doel, het single-stranded gedeelte van de fluorescente sonde bindt aan het complement op de doelgroep, en vervolgens door een strand verdringt polymerase is uitgebreid. Verdere uitbreiding van de polymerase door omgekeerde inleidingen zorgt ervoor dat de scheiding van het quencher deel van haar aanvullende fluorescently geëtiketteerde strand, waardoor de uitstoot van fluorescentie ()figuur 1B). Met dit ontwerp, wordt het signaal gegenereerd na de vorming van de halter, vermindering van de kans op vals-positieve signalen.
Het double-stranded gedeelte van de sonde strand-verdringt kan een willekeurige tekenreeks, en wanneer multiplexing wordt toegepast, dezelfde volgorde kan worden gebruikt met verschillende fluorophore-quencher-paren. Met deze het platform, virus-besmette urine, serum of mug kennisgemaakt monsters squished op papier rechtstreeks met de bepaling zonder bereiding van de monsters. Drie kleuren fluorescentie read-outs zichtbaar voor het menselijk oog werden gegenereerd binnen 30-45 min en signalen waren gevisualiseerd door een 3D-gedrukte observatie-box die gebruikmaakt van een blauwe LED en een oranje filter. Trekkers van de RT-LAMP reagentia ingeschakeld implementatie van deze kit te verlagen van broninstellingen zonder behoefte aan koeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muggen overgebrachte virussen waaronder Zika, dengue en chikungunya bedreigen de volksgezondheid en de recente Zika uitbraken hoogtepunt de behoefte aan goedkope point-of-care detectie alternatieven voor diagnostische gegevens van de patiënt, alsmede voor mosquito toezicht. Isotherme amplificatie methoden werden ontwikkeld als betaalbare alternatieven voor PCR-gebaseerde systemen. RT-LAMP-gebaseerde platforms zijn in het bijzonder toegepast op te sporen van een breed scala van ziekteverwekkers. Echter is het gebruik van…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door FDOH-7ZK15 en NIAID 1R21AI128188-01. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, en gedeeltelijk door de biomedische Research programma van Florida Department of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH of Florida Department of Health. Dynamische combinatoriële chemie LLC is erkend voor hun steun en hun bijdrage aan dit project.
Knokkelkoorts 1 virus (stam BOL-KW010) werd vriendelijk geleverd door het Florida departement van gezondheid Bureau van laboratoria. Zika-virus en de Aziatische afkomst van chikungunya-virus werden genadig verstrekt door de Centers voor Disease Control and Prevention. De bloedlijn van de Indische Oceaan van chikungunya-virus werd beschikbaar gesteld door Robert Tesh (World Reference Center voor opkomende virussen en Arboviruses, door de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston, Texas) aan de UF-FMEL. Wij danken S. Bellamy, B. Eastmond S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer en K. Zirbel voor hulp bij de studies van de infectie. Wij danken ook M. S. Kim voor het verstrekken van Q-papier.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
Referências
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).
