L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1
Summary
Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.
Abstract
Zika, virus chikungunya et la dengue sont transmis par les moustiques, responsables de maladies ayant des symptômes similaires de patients. Cependant, ils ont des potentiels de transmission différent de patient à l’autre en aval et nécessitent des traitements pour les patients très différents. Ainsi, les flambées récentes de Zika qu’il est urgent de développer des outils qui sont discriminatoires rapidement ces virus chez les patients et pris au piège à moustiques, de sélectionner le bon traitement des patients et à comprendre et à gérer leur épidémiologie en temps réel.
Malheureusement, les tests de diagnostic actuels, y compris les urgences 2016 récepteur utiliser autorisations et accélérée statut, détecter l’ARN viral par reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), qui exige d’instrumentation, formation utilisateurs, et préparation de l’échantillon considérable. Par conséquent, elles doivent être transmises à des laboratoires de référence « approuvés », exigeant des temps. En effet, en août 2016, le Center for Disease Control (CDC) demandait les femmes enceintes qui avait été piqué par un moustique et présenté une éruption de Zika-indiquant d’attendre un inacceptable de 2 à 4 semaines avant d’apprendre qu’elles étaient infectées. Nous avons tellement besoin de tests qui peuvent être faits sur place, avec peu de ressources et par un personnel qualifié, mais pas nécessairement sous licence.
Cette vidéo montre un test répondant à ces spécifications, travaillant avec l’urine ou de sérum (pour les patients) ou de carcasses de moustiques écrasés (pour la surveillance de l’environnement), tout cela sans beaucoup de préparation échantillon. Carcasses de moustique sont capturées sur papier portant des groupes de d’ammonium quaternaire (papier Q) suivies par un traitement de l’ammoniaque pour gérer les risques biologiques. Ceux-ci sont ensuite directement, sans isolement d’ARN, mis dans des tubes à essai contenant des réactifs lyophilisés nécessitant aucune chaîne du froid. Une forme modifiée de la transcription inverse boucle-mediated amplification isotherme avec sondes déplaçables fluorescent étiquetés spécifique à la cible produit lecture, en 30 min, comme un signal de fluorescence trois couleurs. C’est visualisé avec un dispositif de poche, piles, avec un filtre orange. Contamination directe est empêchée avec des tubes scellés et l’utilisation de thermolabile uracile DNA glycosylase (UDG) en présence de dUTP dans le mélange d’amplification.
Introduction
Infections à virus transmises par les moustiques, y compris virus Zika, chikungunya et la dengue sont sur les stratégies de prise en charge immédiate de montée et de la demande. Virus de la dengue et le chikungunya sont déjà endémiques dans nombreuses régions tropicales où Zika se répand maintenant dans l’ hémisphère occidental1. Zika virus, comme la dengue, est membre de la famille des Flaviviridae et est originaire d’Afrique avec un asiatique et deux lignées génétiques africaine2. Même si l’identification du virus Zika remonte à 1947, Zika infection chez l’homme est restée sporadique pendant un demi-siècle avant d’émerger dans le Pacifique et les Amériques. La première épidémie signalée de Zika fièvre s’est produite sur l’île de Yap dans les États fédérés de Micronésie, en 2007, suivie de la Polynésie Français en 2013 et 2014. La première épidémie majeure dans les Amériques a eu lieu en 2015 au Brésil.
Virus Zika, chikungunya et la dengue sont transmis principalement par Aedes aegypti et Aedes albopictus. Cependant, Zika a les possibilités de transmission de humain en aval supplémentaire, probablement, se réparties par contact sexuel, l’interaction mère-à-foetus et via l’allaitement3,4,5. Zika fièvre pensait tout d’abord à provoquer une maladie bénigne seulement. Cependant, il fut plus tard associée à syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte, une microcéphalie chez les nouveau-nés et des maladies musculo-squelettiques chroniques qui peuvent le mois derniers à ans. Diagnostic de la maladie de Zika peut être difficile, étant donné que les symptômes d’une infection de Zika sont semblables à celles des autres virus moustique-propagation6. Co-infections communes de ces virus font Diagnostics différentiels, encore plus difficile7,8. Par conséquent, la détection rapide et fiable des acides nucléiques de Zika et d’autres virus est nécessaire pour comprendre épidémiologie en temps réel, d’engager des mesures préventives et contrôle et de gérer les soins aux patients,9.
Les tests de diagnostic actuels pour ces virus incluent des tests sérologiques, isolement du virus, virus séquençage et PCR de transcription inverse (RT-PCR). Des procédures types sérologiques souffrent souvent de sensibilité insuffisante et résultats peuvent être compliquées par réaction croisée chez les patients qui ont déjà été infectés par les autres flavivirus.
Test de dépistage reste donc le moyen le plus fiable pour détecter et différencier ces virus. Détection de Zika et autres virus transmissibles par le moustique est généralement réalisée à l’aide de RT-PCR ou RT-PCR en temps réel dans une variété de liquides biologiques, comme le sérum, urine, salive, sperme, le lait maternel et le liquide cérébral10,11. Échantillons d’urine et la salive sont généralement préférés au sang, puisqu’ils montrent moins de PCR-inhibition, une charge virale supérieure, présence de virus pour des périodes plus longues et une facilité accrue de prélèvement et de manipulation de12,13. Tests de diagnostic à base de RT-PCR, toutefois, comprennent des étapes de préparation d’échantillon vaste et coûteux équipement cyclisme thermique, rendant moins optimal pour le point-of-care.
Transcription inverse amplification isotherme boucle-négociée (RT-lampe) a émergé comme une alternative de RT-PCR puissante grâce à sa haute sensibilité et spécificité14, sa tolérance pour des substances inhibitrices dans biological samples15, et opération sur la température unique, qui a considérablement réduit dosage complexité et les coûts connexes, adapté aux environnements de faibles ressources. RT-lampe, telle qu’elle est implémentée classiquement, comprend six amorces qui se lient aux huit régions distinctes au sein de l’ARN cible. Il fonctionne à des températures constantes entre 60 ° et 70 ° C et utilise une transcriptase inverse et une ADN polymérase avec fil fort déplacement de l’activité.
Pendant les premières étapes de RT-lampe, amorces internes avant et arrière (FIP et BIP, Figure 1 a) avec des amorces avant et arrière extérieures (F3 et B3) forment une structure de l’haltère, la structure de la graine d’amplification exponentielle de lampe. L’amplification est encore accélérée par les boucle avant et en arrière des amorces (LF et LB), qui visent à lier les régions simples brin de l’haltère, et conduit à la formation de concatémères répétés plusieurs boucles16. Turbidité basée sur des analyses de lampe classique ou affichage par ADN intercalant colorants n’est pas tout à fait adapté pour détection de point-of-care de Zika, où certains niveau de multiplexage est désiré17,18,19. Multiplexage par répartition n’est pas facilement obtenu dans ces systèmes, car ils sont susceptibles de générer des faux positifs en raison de l’amplification hors cible.
Pour gérer ces questions, la littérature ajoute une composante supplémentaire sous la forme d’une « sonde de brin-déplacement » à la RT-lampe classique architecture20,21,22. Chaque sonde est une région de double-brin de séquence-spécifique et une région simple brin d’amorçage. La sonde avec la région monocaténaire est étiquetée avec un fluorophore 5′, et la sonde complémentaire est modifiée avec un extincteur d’extrémité 3′. En l’absence d’une cible, aucune fluorescence n’est observée en raison de l’hybridation des brins complémentaires de sonde, qui apporte le fluorophore et extincteur à proximité. En présence d’une cible, la portion monocaténaire de la sonde fluorescente se lie à son effectif sur la cible et est ensuite étendue par un brin déplaçant polymérase. Prolongation de polymérase amorces inverse provoque la séparation du brin désactivateur de son brin complémentaire fluorescent étiqueté, permettant l’émission de fluorescence (Figure 1 b)) . Grâce à cette conception, le signal est généré après la formation de l’haltère, réduisant les chances de signaux de faux-positifs.
La partie double-brin de la sonde strand-déplacement peut être une séquence et multiplexage est appliqué, la même séquence peut-être être utilisée avec les paires différentes fluorophore-extincteur. Avec cette architecture, urine contaminée par le virus, sérum ou moustique échantillons écrasés sur papier ont été introduits directement à l’essai sans préparation de l’échantillon. Afficheurs de fluorescence trois couleurs visibles à le œil humain ont été obtenues dans les 30-45 min, des signaux ont été visualisés par une boîte d’observation imprimés 3D qui utilise une LED bleue et un filtre orange. Lyophilisation les réactifs de RT-lampe a permis le déploiement de ce kit pour abaisser les paramètres des ressources sans besoin de réfrigération.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virus transmises par les moustiques, y compris Zika, chikungunya et dengue menacent la santé publique et la surbrillance de flambées récente Zika la nécessité des alternatives de détection de point-of-care de faible coût pour le diagnostic de patients, ainsi que pour la surveillance des moustiques. L’amplification isotherme méthodes ont été développées comme solutions de rechange abordables aux systèmes basées sur la PCR. En particulier, RT-lampe-plates-formes ont été appliquées pour détecter un large…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu en partie par 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 et NIAID. Recherche rapporté dans cette publication a été financée en partie par le National Institutes of Allergy and Infectious Diseases et en partie par Biomedical Research Programme du Florida Department of Health. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH ou Florida Department of Health. LLC de chimie combinatoire dynamique est reconnu pour leur soutien et leur contribution à ce projet.
Virus de la dengue 1 (souche BOL-KW010) a été aimablement fourni par le département de Florida le Bureau santé des laboratoires. Zika virus et la lignée asiatique du virus du chikungunya ont été gracieusement fournis par les centres pour Disease Control and Prevention. La lignée de l’océan Indien du virus chikungunya a été aimablement fournie par Robert Tesh (Centre de référence mondiale pour les virus émergents et arbovirus, par le biais de l’University of Texas Medical Branch à Galveston, Texas, États-Unis) à l’UF-FMEL. Nous remercions S. Bellamy, B. Edouard, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, ZimLer r. et K. Zirbel d’assistance avec les études d’infection. Nous remercions également M. S. Kim pour la fourniture de papier Q.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
Referências
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).
