הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1
Summary
זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.
Abstract
Zika דנגה, chikungunya וירוסים מועברים על ידי יתושים, גורמות למחלות עם תסמינים דומים החולה. עם זאת, יש פוטנציאל שידור שונות-לחולה במורד הזרם והם דורשים טיפולים שונים מאוד סבלני. לפיכך, התפרצויות שאירעו לאחרונה Zika דבר דחוף לפתח את הכלים במהירות מפלים וירוסים אלה בחולים, לכוד היתושים, לבחירת הטיפול המטופל הנכון, וכדי להבין ולנהל אפידמיולוגיה שלהם בזמן אמת.
למרבה הצער, בדיקות אבחון הנוכחי, כולל אלה חירום 2016 המקבל להשתמש אישורים ואת המהירות מצב, לזהות RNA נגיפי על ידי שעתוק במהופך תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR), אשר דורשת מכשור, אימן משתמשים, ו הכנת הדוגמא ניכר. לפיכך, הם יש לשלוח למעבדות הפניה “מאושרים”, הדורשים זמן. אכן, אוגוסט 2016, מרכז בקרת מחלות (CDC) שאל נשים בהריון שהיו ננשך על ידי יתוש ופיתח פריחה המציין Zika לחכות מתקבל על הדעת 2 כדי 4 שבועות לפני לימוד, בין אם הם נדבקו. אנחנו מאוד זקוקים בדיקות שניתן לעשות באתר, עם מעט משאבים, ועל -ידי צוות מיומן אך לא בהכרח מורשה.
וידאו זה מדגים וזמינותו שעונה מפרטים אלה, עבודה עם שתן או סרום (עבור חולים) או פגרי יתושים מעוכים (למעקב סביבתית), כל זאת ללא הכנת הדוגמא הרבה. יתוש הגוויות נלכדים על נייר נושאת אמוניום רבעוני קבוצות (Q-נייר) ואחריו טיפול אמוניה כדי לנהל את הנגועים. אלה מכן ישירות, ללא בידוד ה-RNA, מוכנסים לתוך צינורות assay המכיל ריאגנטים הליחה צריך שום שרשרת קירור. צורה שונה של שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים מתויגות fluorescently במטרה מייצר העתק, 30 דקות, כאות פלורסצנטיות תלת-צבעי. זה הוא מדמיין עם התקן כף-יד, המופעלים באמצעות סוללות עם מסנן כתום. זיהום קדימה נמנעת עם צינורות אטום, השימוש של אורציל thermolabile דנ א glycosylase (UDG) בנוכחות dUTP בתערובת הגברה.
Introduction
זיהומים וירוס בעקיצות יתוש, לרבות קדחת דנגה, chikungunya Zika וירוסים הם על אסטרטגיות הניהול המיידית עלייה וביקוש. קדחת דנגה וירוסים chikungunya אנדמיים כבר רבות של האזורים הטרופיים איפה Zika מתפשטת עכשיו חצי הכדור המערבי1. וירוס Zika, כמו קדחת דנגה, חבר של משפחת Flaviviridae , הוא יליד אפריקה עם אחד אסיה אפריקה שושלות גנטיות שני2. אף-על-פי זיהוי הווירוס Zika שתחילתה 1947, Zika זיהום בבני נשאר סדיר במשך מאה וחצי לפני המתעוררים באוקיינוס השקט, אמריקה. פרוץ המדווחת הראשונה Zika חום אירעה על האי של הפה, מיקרונזיה בשנת 2007, ואחריו פולינזיה הצרפתית 2013 ו- 2014. ההתפרצות הראשונה הגדולות ביבשת אמריקה אירעה בשנת 2015 בברזיל.
Zika chikungunya, קדחת דנגה וירוסים מועברים בעיקר על ידי Aedes aegypti אדס מפוספס. עם זאת, Zika בעל אפשרויות שידור נוספים אדם אל אדם במורד הזרם, צפויה להתפשט דרך מגע מיני, אינטראקציה אמא-כדי-העובר, ולא באמצעות הנקה3,4,5. קדחת Zika האמינו תחילה כדי לגרום למחלה קלה בלבד. עם זאת, זה היה אח כ הקשורים עם תסמונת גיליאן במבוגרים, microcephaly neonates, במחלות כרוניות השלד והשרירים אולי חודשים עד שנים. אבחון של מחלה Zika עשויה להיות מאתגרת, מאז הסימפטומים של זיהום Zika דומים לאלה של אחרים נגד יתושים-התפשטות וירוסים6. זיהומים נפוצים שיתוף של וירוסים אלה הפוך אבחנות יותר מאתגר7,8. לכן, זיהוי מהיר ואמין חומצות גרעין מפני Zika ווירוסים אחרים יש צורך להבין אפידמיולוגיה בזמן אמת, כדי ליזום אמצעי מניעה ובקרה, ניהול הטיפול בחולה9.
בדיקות אבחון הנוכחי עבור וירוסים אלה כוללים בדיקות סרולוגית, בידוד וירוס, וירוס רצף הפוכה-תמלול PCR (RT-PCR). גישות סרולוגית רגיל סובלים לעתים קרובות רגישות לקוי, תוצאות יכול להיות מסובך אשיג בחולים שנדבקו בעבר על ידי אחרים flaviviruses.
לכן, בדיקות חומצות גרעין נשאר הדרך האמינה ביותר ויוכל להבדיל וירוסים אלה. זיהוי של Zika ווירוסים אחרים בעקיצות יתושים מתבצעת בדרך כלל באמצעות RT-PCR או בזמן אמת RT-PCR במגוון הביולוגי נוזלים, כמו סרום, השתן, רוק, זרע, חלב ו- נוזל מוחי10,11. דגימות שתן ורוק עדיפים בדרך כלל על דם, מאחר שהם מייצגים פחות PCR-עיכוב, מטענים נגיפי גבוה יותר, נוכחות וירוס עבור תקופות זמן ארוכות יותר וקלות מוגברת של איסוף וטיפול12,13. RT-PCR מבוססי בדיקות אבחון, עם זאת, מהווים צעדים הכנה דגימה נרחבת, ציוד רכיבה על אופניים תרמי יקר, עושה את זה פחות אופטימלי בשלב של הטיפול.
שעתוק במהופך בתיווך לופ הגברה איזותרמי (RT-המנורה) התפתחה בתור חלופה RT-PCR חזק בשל רגישות גבוהה שלה ירידה לפרטים14, שלה עמידות לחומרים מעכבות בביולוגית דגימות15, ו מבצע על טמפרטורה יחיד, אשר באופן משמעותי assay מפחית את המורכבות ואת עלויות, שהופך אותו מתאים לסביבות משאבים נמוכה. RT-המנורה, כמו זה מיושם באופן קלאסי, מונה שישה צבעי יסוד זה לאגד שמונה אזורים הנבדלים זה מזה בטווח המטרה RNA. זה פועל בטמפרטורות מתמדת בין 60 ° C ו- 70 מעלות צלזיוס, ומשתמש של רוורס טרנסקריפטאז, של ה-DNA פולימראז עם חוט חזק ועקרו מבתיהם פעילות.
במהלך בשלבים ההתחלתיים של RT-המנורה, קדימה ואחורה פנימי תחל (FIP, ביפ, איור 1A) יחד עם תחל קדימה ואחורה החיצוני (F3 ו- B3) יוצרות מבנה המשקולת, מבנה הזרע הגברה המנורה מעריכית. הגברה נוספת מואץ על ידי הלולאה קדימה ואחורה תחל (אם ו LB), אשר נועדו לקשור אזורים נטושים יחיד המשקולת, תוצאות על היווצרות concatemers עם חוזרים מרובים לולאות16. המנורה קלאסית מבחני בהתבסס על עכירות או הבדיקה על ידי ה-DNA intercalating צבע הוא לא לגמרי מתאים עבור זיהוי בשלב של טיפול Zika, איפה רמה מסוימת של ריבוב הרצוי17,18,19. ריבוב לא בקלות מתקבל במערכות אלו, כפי שהם נוטים ליצור שווא-תוצאות חיוביות בשל ביטול-יעד amplifications.
כדי לנהל את הסוגיות הללו, הספרות מוסיפה מרכיב חשוב נוסף בדמות “החללית ועקרו מבתיהם strand” קלאסית RT-המנורה אדריכלות20,21,22. כל בדיקה יש אזור כפול-strand רצף ספציפי, אזור חד גדילי לקרקע. החללית עם האזור חד גדילי המתויגת של 5′-fluorophore, החללית משלימים משתנה עם כ’חטיף 3′-end. בהעדר מטרה, אין קרינה פלואורסצנטית הוא ציין עקב הכלאה של גדילים משלימים בדיקה, אשר מביא את fluorophore ואת כ’חטיף לתוך קרבה. בנוכחות מטרה, החלק חד גדילי של החללית פלורסנט נקשר המשלים שלו על המטרה ולאחר מכן נמתח חוט ועקרו מבתיהם פולימראז. הארכה נוספת פולימראז מאת תחל הפוך גורם ההפרדה של סטרנד כ’חטיף מ שלה strand fluorescently שכותרתו משלימים, המאפשר פליטת קרינה פלואורסצנטית (איור 1B). עם העיצוב הזה, האות נוצר לאחר היווצרות המשקולת, להפחית את הסיכויים של אותות חיובי-false.
החלק גדילי כפול של החללית ועקרו מבתיהם סטרנד יכול להיות כל רצף, כאשר ריבוב מוחל, ניתן להשתמש באותו הרצף עם fluorophore שונים-כ’חטיף זוגות. זו ארכיטקטורה, השתן נגוע וירוסים, סרום או יתוש דגימות זחלים וחרקים על נייר הוכנסו ישירות הבדיקה ללא הכנת הדוגמא. הקריאות תלת-צבעי זריחה גלויים לעין האנושית נוצרו בתוך 30-45 דקות, אותות היו דמיינו ידי תיבה תצפית מודפס 3D משתמש LED כחול של מסנן כתום. ליופיליזציה ריאגנטים RT-המנורה איפשרה פריסה של הקיט הזה כדי להוריד את הגדרות משאבים ללא צורך קירור.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעקיצות יתוש וירוסים כולל Zika, chikungunya דנגה מאיימים בריאות הציבור והאר האחרונות Zika התפרצויות הצורך חלופות בעלות נמוכה בשלב של טיפול הזיהוי אבחון המטופל, כמו גם עבור יתושים מעקב. הגברה איזותרמי שיטות פותחו חלופות במחיר סביר במערכות מבוססות-PCR כמו. במיוחד, RT-המנורה מבוססי פלטפורמות הוחלו לאית?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמך בחלקה על ידי FDOH-7ZK15, NIAID 1R21AI128188-01. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך בחלקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, ובחלק מאת ביו מחקר תוכנית של פלורידה משרד הבריאות. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של NIH או משרד הבריאות של פלורידה. LLC כימיה קומבינטורית דינמי הוא הודה על תמיכתם תרומה לפרוייקט זה.
וירוס דנגה 1 (זן בול-KW010) היה בחביבות שסופקו על-ידי פלורידה המחלקה של בריאות הלשכה של מעבדות. Zika וירוס ולא את שושלת היוחסין אסיה של וירוס chikungunya נמסרו באדיבות על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן. שושלת היוחסין של האוקיינוס ההודי של וירוס chikungunya סופק באדיבות על ידי רוברט טש (הפניה למרכז עולמי המתעוררים וירוסים, Arboviruses, דרך הסניף הרפואה באוניברסיטת טקסס, בגאלבסטון, טקסס) כדי UF-FMEL. אנו מודים ס בלאמי B. Eastmond, ס’ אורטיז, ד ולז, ק’ ויגינס, ZimLer רבי, ק’ זירבל לקבלת סיוע עם המחקרים זיהום. אנו מודים גם מ ס קים למתן Q-נייר.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
Referências
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).
