Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR
Summary
Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.
Abstract
CDH1a, eine nicht-kanonischen Abschrift des CDH1 -Gens hat gefunden worden, um in einigen Zelllinien von Magenkrebs (GC) ausgedrückt werden, während er fehlt in normale Magenschleimhaut. Vor kurzem erkannt wir CDH1a Abschrift Variante in Tiefkühlfrische Tumorgewebe von Patienten mit GC erhalten. Der Ausdruck dieser Variante in Gewebeproben wurde von der Chip-basierten digitalen PCR (dPCR) Ansatz hier vorgestellten untersucht. dPCR bietet das Potential für eine präzise, robust und hochempfindlichen Messung von Nukleinsäuren und wird zunehmend für viele Anwendungen in verschiedenen Bereichen genutzt. dPCR ist in der Lage erkennen selten Ziele; Darüber hinaus bietet dPCR die Möglichkeit für absolute und präzise Quantifizierung von Nukleinsäuren ohne die Notwendigkeit für Kalibratoren und Standardkurven. In der Tat bereichert die Reaktion Partitionierung das Ziel aus dem Hintergrund, der Verstärkung Effizienz und Toleranz gegenüber Inhibitoren verbessert. Diese Eigenschaften machen dPCR ein optimales Tool für die Erkennung der CDH1a selten Abschrift.
Introduction
Das CDH1 -Gen kodiert für E-Cadherin, ein entscheidender Faktor bei der Aufrechterhaltung der normalen Magen Epithel durch die Regulierung der Zelle Adhäsion, überleben, Proliferation und Migration1beteiligt. Verlust von E-Cadherin-Protein durch schädliche Keimbahn oder somatischen Veränderungen des CDH1 wurde die Entwicklung von GC2,3zugeordnet. Nicht-kanonische Transkripte aus Intron 2 des Gens haben auch vermutet, um eine Rolle im Magen Karzinogenese4,5. Insbesondere eine solche Abschrift, CDH1a, hat gezeigt, dass im GC Zell-Linien ausgedrückt werden aber fehlt aus dem normalen Magen-4. Wir haben vor kurzem CDH1a in GC Gewebeproben von GC Patienten mittels Chip-basierte dPCR5festgestellt. dPCR wurde verwendet, um zum ersten Mal das Vorhandensein der CDH1a gen Abschrift im Darm GC und im Normalgewebe zu bewerten.
Die Gold-Standard-Methode zur Bestimmung der Genexpression ist real-time quantitative PCR (qPCR). Die resultierenden Daten können jedoch manchmal Variable und von schlechter Qualität, vor allem wenn das Ziel in der Probe ist gering. Diese Variabilität kann durch Verunreinigungen, die Polymeraseaktivität und Grundierung glühen, hemmen, führt zu unspezifischen Verstärkung und wettbewerbsfähige Seite Reaktionen6verursacht werden.
Obwohl die biochemischen Grundlagen der dPCR ähnlich denen der qPCR sind dPCR zeigt einige Vorteile, so dass für sehr genaue Messungen von genomischer DNA (gDNA) / ergänzende DNA (cDNA) Moleküle. In der Tat ist dPCR ein Endpunkt Reaktion, die stützt sich auf die kalibrierten Partitionierung einer Probe in Tausende von Brunnen, so dass jeder gut Null oder ein Einzelziel-Molekül enthält. Verstärkung dann tritt nur in den Vertiefungen, die mit einer Kopie des Ziels und wird durch ein Fluoreszenzsignal angezeigt. Die absolute Zahl der Zielmoleküle in der ursprünglichen Probe kann dann berechnet werden, bestimmen das Verhältnis von positiven zu total Partitionen mit binomischen Poisson Statistiken7.
Darüber hinaus die dPCR Technik eliminiert die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt und somit die damit verbundenen Vorurteile und Variabilität, so dass für eine direkte Quantifizierung der Ziele8,9; Es liefert präzise und reproduzierbare Ergebnisse unabhängig von Verunreinigungen und Effizienz durch seine hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren10; Es ist empfindlicher und spezifischer als qPCR und ist somit eine zuverlässige Methode zum Nachweis von seltenen Ziel. Schließlich die Aufteilung der Probe in mehrere Reaktionen reduziert den Wettbewerb mit Hintergrund-Moleküle und verbessert die Grenze der Zielerfassung, wodurch Verstärkung möglich und erleichtert die Erkennung von einzelnen Molekülen gDNA/cDNA6 . Die Erkennung und Quantifizierung von Nukleinsäuren durch Chip-basierte dPCR zunehmend zum Kopieren von Nummer Variante angewendet wurde, Quantifizierung von DNA-Fragmenten und Mutation analysiert11,12,13, angesichts der Präzision und geringen Material Eingang Anforderung der Methode. Darüber hinaus wurde vor kurzem dPCR in die Analyse der beiden Micro-RNAs14 und gen Transkripte5,15integriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
dPCR wurde ursprünglich entwickelt für DNA-molekulare Messungen10,11,12,13 und in der Zeit, die diese Technologie adaptiert wurde für die Quantifizierung von Micro-RNA und RNA Transkripte5, 14,15. In diesem Protokoll haben wir erweitert die Liste der Anwendungen zur Erkennung von seltenen Transkrip…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung.
Materials
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
Referências
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