Oppdagelsen av en CDH1 sjeldne transkripsjon Variant i fersk-frosne magekreft vev av Chip-baserte digitale PCR
Summary
Manuskriptet beskriver en chip-baserte digitale PCR-analysen for å oppdage en sjelden CDH1 transkripsjon variant (CDH1a) i fersk-frosne normal og tumor vev innhentes fra pasienter med magekreft.
Abstract
CDH1a, en ikke-kanoniske transkripsjon av CDH1 genet, har blitt funnet for å uttrykkes i noen magekreft (GC) linjer, mens det er fraværende i normal mage mucosa. Nylig oppdaget vi CDH1a transkripsjon variant i fersk-frosne tumor vev innhentes fra pasienter med GC. Uttrykket i denne varianten i vevsprøver ble undersøkt av chip-baserte digitale PCR (dPCR) tilnærming presenteres her. dPCR tilbyr muligheter for en nøyaktig, robust og svært følsom måling av nukleinsyrer og benyttes stadig for mange programmer i ulike felt. dPCR er i stand til å oppdage sjeldne mål; i tillegg tilbyr dPCR muligheten for absolutt og presis kvantifisering av nukleinsyrer uten behov for kalibratorer og standard kurver. Faktisk beriker reaksjon partisjonering målet fra bakgrunnen, som forbedrer forsterkning toleranse hemmere. Egenskaper gjør dPCR en optimal verktøy for deteksjon av CDH1a sjeldne transkripsjon.
Introduction
CDH1 genet koder for E-cadherin, en nøkkelfaktor som er involvert i vedlikehold av normal mage epitel gjennom regulering av celle vedheft, overlevelse, spredning og migrasjon1. Tap av E-cadherin protein som følge av skadelige germline eller somatiske endringer av CDH1 har vært knyttet til utviklingen av GC2,3. Ikke-kanoniske transkripsjoner fremkommer fra intron 2 av genet har også vært antatt spille en rolle i mage kreft4,5. Spesielt en slik transkripsjon, CDH1a, har vist seg å bli uttrykt i GC cellelinjer men er fraværende fra de normale mage4. Vi har nylig oppdaget CDH1a i GC vevsprøver fra GC pasienter bruker chip-baserte dPCR5. dPCR ble brukt til å vurdere, for første gang, tilstedeværelse av CDH1a genet transkripsjon intestinal GC og normalt vev.
Metoden gullstandarden å bestemme genuttrykk er sanntid kvantitative PCR (qPCR). Men resultatdataene kan være variabel og med dårlig kvalitet, spesielt når målet i utvalget er lav. Denne variasjonen kan være forårsaket av forurensning, som hemmer polymerase aktivitet og primer annealing, fører til ikke-spesifikk forsterkning og konkurrerende side reaksjoner6.
Selv om biokjemiske grunnprinsippene for dPCR er lik de i qPCR, dPCR viser noen fordeler, slik at for svært presise målinger av genomisk DNA (gDNA) / komplementære DNA (cDNA) molekyler. DPCR er faktisk en end-point reaksjon som kalibrert partisjonering av et utvalg i tusenvis av brønner, slik at hver også inneholder null eller et enkelt mål molekylet. Forsterkning så skjer kun i brønnene som inneholder en kopi av målet og er merket med et fluorescerende signal. Absolutte antallet målmolekyler i den opprinnelige prøven kan deretter beregnes ved å bestemme forholdet mellom positive til totalt partisjoner bruker binomiske Poisson statistikk7.
I tillegg dPCR teknikken eliminerer behovet for å kjøre en standard kurve, og derfor den tilknyttede partiskhet og variasjon, slik at for en direkte kvantifisering av mål8,9; Det gir mer presis og reproduserbar resultater uavhengig av forurensninger og effektivitet på grunn av dens høy toleranse hemmere10; Det er mer følsom og spesifikk enn qPCR, og er dermed en pålitelig metode for påvisning av en sjelden mål. Endelig partisjonering av prøven inn flere reaksjoner reduserer konkurransen med bakgrunn molekyler og forbedrer grensen på målgjenkjenning, gjør forsterkningen mulig og tilrettelegging påvisning av enkelt molekyler av gDNA/cDNA6 . Gjenkjennings- og kvantifisering av nukleinsyrer ved chip-baserte dPCR har blitt stadig mer brukt for å kopiere nummer variant kvantifisering av DNA fragmenter og mutasjon analyserer11,12,13, gitt den presisjon og lav materiale input kravet til metoden. I tillegg har dPCR nylig blitt integrert i analyse av begge microRNAs14 og gene transkripsjoner5,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
dPCR ble opprinnelig utviklet for DNA, molekylær målinger,10,,11,,12,,13 og i tid denne teknologien ble tilpasset for kvantifisering av microRNAs og RNA transkripsjoner5, 14,15. Vi har utvidet listen over programmer med oppdagelsen av sjeldne transkripsjoner fra frisk-frosne vevsprøver i denne prot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Gráinne Tierney for redaksjonell bistand.
Materials
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
Referências
- van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
- Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).
- Corso, G., et al. Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer. J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).
- Pinheiro, H., et al. Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis. Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).
- Abou Khouzam, R., et al. Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer. Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 7 (1), (2017).
- Basu, A. S. Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR. SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).
- Huggett, J. F., Whale, A. Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics. Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).
- Alikian, M., et al. RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia. Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).
- Hoshino, T., Inagaki, F. Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR. Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Tessitore, M. V., et al. Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs. J.Transl.Med. 15 (1), (2017).
- Sho, S., et al. Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens. PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).
- Conte, D., et al. Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR. BMC Genomics. 16, 849 (2015).
- Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification. PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).
