تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا
Summary
في هذا العمل، ويصف لنا بروتوكولات التحقيق في دور حويصلات خارج الخلية (EVs) صدر عن الكريات الحمراء المنجلية المصابة. على وجه الخصوص، نحن نركز على تفاعلات المركبات الكهربائية مع خلايا بطانية.
Abstract
الملاريا ومرض يهدد الحياة الناجمة عن الطفيليات المتصورة ، و المنجلية الأكثر انتشارا في القارة الأفريقية والمسؤولة عن معظم الوفيات المرتبطة بالملاريا على الصعيد العالمي. العديد من العوامل بما في ذلك عزل الطفيلي في الأنسجة، والخلل في الأوعية الدموية، والاستجابات التهابات تؤثر على تطور المرض في الأشخاص المصابين بالملاريا. المنجلية-خلايا الدم الحمراء المصابة (إيربكس) إطلاق سراح حويصلات خارج الخلية الصغيرة (EVs) التي تحتوي على أنواع مختلفة من جزيئات الشحنات التي تتوسط الاتصال المرضية والخلوية بين الطفيليات والمضيف. المركبات الكهربائية هي كفاءة تناول الخلايا التي كانت تعدل وظيفتها. هنا نناقش استراتيجيات لمعالجة دور المركبات الكهربائية في تفاعلات الطفيلي المضيف. أولاً، نحن تصف طريقة واضحة لوضع العلامات وتعقب تدخيل EV بخلايا بطانية، استخدام صبغة رابط خلية خضراء. ونحن التقرير الثاني، طريقة بسيطة لقياس النفاذية عبر أحادي الطبقة غشائي خلية باستخدام ديكستران مسمى فلوريسسينتلي. وأخيراً، نعرض كيفية التحقيق في دور جزيئات الحمض النووي الريبي غير الترميز صغيرة في وظيفة الخلايا البطانية.
Introduction
ووفقا “منظمة الصحة العالمية”، كانت هناك 212 مليون حالة جديدة من الملاريا في جميع أنحاء العالم بحلول عام 2015 وتوفي حوالي 429,000 شخصا، معظمهم من الأطفال دون سن الخامسة من العمر1. الآليات التي تؤدي إلى المرض الشديد، الذي يرتبط غالباً بالخلل في الأوعية الدموية، ما زالت غير محددة2. تفرز المتصورة-إيربكس صغيرة ثنائية-دهن غشاء المجالات المعروفة باسم حويصلات خارج الخلية (EVs). ومن المعروف أن هذه المركبات الكهربائية التي يحتمل أن تكون ذات الصلة بعملية العدوى والمضيف الاستجابة المناعية للعدوى؛ ومع ذلك، يعرف الكثير عن الدالة exact لهذه الحويصلات الصغيرة أثناء الإصابة بالملاريا3. فمن الممكن أنها تلعب دورين هامين: من ناحية، أنها قد تسهم في التسبب بتفعيل الضامة4،5؛ ومن ناحية أخرى، قد توفق الاتصالات الخلوية بين الطفيليات والطفيليات والمضيف6،7. وفي الواقع، يمكن نقل الطفيليات البروتينات أو الأحماض النووية بين بعضها البعض عن طريق المركبات الكهربائية. على سبيل المثال، المثقبيات البروسية rhodesiense المركبات الكهربائية يمكن نقل عامل فوعة Serum Resistance-Associated (SRA)، ويمكن أن تستهدف الكريات الحمراء المضيفة و البروسية ت أخرى8. وعلاوة على ذلك، المنجلية-إيربكس الاتصال بين بعضها البعض من خلال نقل الأحماض النووية داخل المركبات الكهربائية. وهذا ما يسمح الطفيليات على الوجه الأمثل، وتزامن نموه. في الواقع، قد تكون الجهة الرئيسية المنظمة للتحويل جاميتوسيتي المركبات الكهربائية، وبالتالي المساهمة في تنظيم مرحلة انتقال7.
ليس فقط القيام بتنظيم المركبات الكهربائية الطفيليات، وأنها تتوسط أيضا تفاعلات الطفيلي المضيف. اكتشفنا مؤخرا أن المركبات الكهربائية من إيربكس تحتوي على المستمدة من المضيف ميكرورناس (ميرناس؛ والأنواع الصغيرة من الحمض النووي الريبي في النطاق من 21-25 النيوكليوتيدات9) التي تم تناولها بالخلايا البطانية البشرية. ميرناس في المركبات الكهربائية شكل مستقر معقدة مع Ago2 (عضو لإسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي معقدة)، التي بمجرد تسليمها إلى الخلايا المتلقية، وهو قادر على إسكات الجينات على وجه التحديد والتي تؤثر على خصائص الخلايا10الحاجز. وقد وضعت البروتوكولات القياسية للتحقيق في وظيفة المركبات الكهربائية. وهنا يصف لنا أولاً بروتوكول يسمح للعلامات الفلورية للمركبات الكهربائية للتحقيق على امتصاص الخلايا المتلقية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مجهر [كنفوكل]، من الممكن تتبع مصير EV داخل الخلية. يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية لتعقب المركبات الكهربائية. صبغ أمين المتفاعلة واستر اسيتات-(and-6)-كاربوكسيفلوريسسين 5 سوكسينيميديل (CFSE) ونيون كالسين-صباحا تصبح مرة واحدة داخل الحويصلات. نحن نفضل استخدام التسمية أمفيفيليك، بخ، لأنه يعطي إشارة أكثر إشراقا وأكثر توحيدا. هذا النهج يوفر معلومات هامة فهم التفاعلات بين المركبات الكهربائية والخلايا المتلقية. بينما في بعض الحالات ربط المركبات الكهربائية على سطح الخلايا، سرعة قصرت بعض الحويصلات. عند امتصاص، يسلم المركبات الكهربائية على الشحنات إلى الخلايا، التي كانت تمارس مهامها التنظيمية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لقياس وظيفة حاجز غشائي الخلايا في المختبر بالتحديد الكمي لنقل ديكستران الفلورسنت من خلال أحادي الطبقة خلوية. ويمكن استخدام تتبع أكثر حساسية مثل علامات راديولابيليد. ومع ذلك، أنها تتطلب احتياطات سلامة خاصة للاستخدام. توجد فحوصات أخرى لقياس وظيفة الحاجز في المختبر مثل المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال (طير)، الذي يقيس سلامة مفرق ضيق. وأخيراً تصور زوي-1، بروتين مفرق ضيق، قبل الفلورة يسمح تقييم سلامة مفرق ضيق ك جيدا10. وبالمركبات الكهربائية كيانات معقدة وغير متجانسة تحتوي على شحنات عدة مع الخصائص التنظيمية المحتملة، من المفيد أوفيريكسبريس الحمض النووي الريبي محددة لدراسة تأثيرها على الخلية المتلقية. ولذلك، نحن أيضا تعريف بروتوكول الذي يهدف إلى إنشاء خطوط الخلايا مستقر معربا عن ميرنا لفائدة10.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطفيليات عدة، بما في ذلك التوكسوبلازما ومثقبيه ليشمانيا المشعرة يؤدي إلى الإفراج عن المركبات الكهربائية بالخلية المضيفة المصابة. اعتماداً على مسببات الأمراض، يمكن أن تعدل الاستجابة المناعية المضيف EVs المفرج عنهم أو التوسط في الاتصالات الخلوية بين الطفيليات6. حتى الآن، هنا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كان دعم مالي في جزء من مؤسسة نوفارتيس الطبية-والبحوث البيولوجية (ليم) غوتفريد وجوليا بانجتر-رهينير-ستيفتونغ (إلى ميغاواط ويم) ومجمع البحوث جامعة فريبورغ (ليم). منح إضافية تشمل “المنح الحكومة السويسرية على التميز” “الباحثين الأجانب” (لكاب و SM). ونحن نشكر سولانج كروبي هيس وفلي إيزابيل للدعم التقني.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
Referências
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
