Evaluering av ekstracellulære Vesicle funksjonen under Malaria smitte
Summary
I dette arbeidet beskriver vi for å undersøke hvilken rolle ekstracellulære blemmer (EVs) utgitt av Plasmodium falciparum infisert erytrocytter. Spesielt fokusere vi på EVs samhandling med endotelceller.
Abstract
Malaria er en livstruende sykdom forårsaket av Plasmodium parasitter, med P. falciparum er den mest utbredte på det afrikanske kontinentet og ansvarlig for de fleste malaria-dødsfall globalt. Flere faktorer, inkludert parasite lagring i vev, vaskulære dysfunksjon og provoserende svar påvirke utviklingen av sykdom i malaria-smittede personer. P. falciparum-infiserte røde blod celler (iRBCs) slipper små ekstracellulære blemmer (EVs) med ulike typer Last molekyler som megle patogenesen og mobil kommunikasjon mellom parasitter og vert. EVs blir effektivt tatt opp av cellene der de modulerer sin funksjon. Her kan vi diskutere strategier for å håndtere EVs rolle i parasitten vert interaksjoner. Først beskriver vi en enkel metode for merking og oppsporer EV internalisering av endotelceller, bruke en grønn celle koblingsfunksjonalitet fargestoff. Andre rapportere vi en enkel måte å måle permeabilitet over en endothelial celle monolayer ved hjelp av en fluorescently merket dekstran. Endelig viser vi hvordan å undersøke rollen som små ikke-koding RNA molekyler i endothelial celle funksjon.
Introduction
Ifølge Verdens helseorganisasjon, det var 212 millioner nye tilfeller av malaria verden over i 2015 og rundt 429,000 mennesker døde, hovedsakelig barn under fem år av alderen1. Mekanismene fører til alvorlig sykdom, som er ofte forbundet med vaskulær dysfunksjon, fortsatt dårlig definerte2. Plasmodium– iRBCs skiller liten bi-lipid membran kuler kalles ekstracellulære blemmer (EVs). Det er kjent at disse EVs er potensielt relevant infeksjon prosessen og vert immun respons på infeksjon; men er lite kjent om den eksakte funksjonen til disse små blemmer under malaria smitte3. Det er mulig at de spiller to viktige rollene: på den ene siden de kan bidra til patogenesen ved å aktivere makrofager4,5; og på den annen side, de kan megle mobil kommunikasjon mellom parasitter og mellom parasitter og vert6,7. Faktisk kan parasitter overføre proteiner eller nukleinsyrer mellom hverandre via EVs. For eksempel Trypanosoma brucei rhodesiense EVs kan overføre virulens faktor Serum Resistance-Associated (SRA) og kan målrette både andre T. brucei og vert erytrocytter8. Videre kommunikasjon P. falciparum– iRBCs mellom hverandre ved å overføre nukleinsyrer innen EVs. Dette gjør parasites å optimalisere og synkronisere sin vekst. EVs kan faktisk være viktig regulator av gametocyte, og derfor bidra til regulering av overføring trinn7.
Ikke bare gjøre EVs regulere parasitter, de også megle parasitten vert interaksjoner. Vi har nylig oppdaget at EVs fra iRBCs inneholder vert-avledet microRNAs (miRNAs, liten RNA arter i området av 21-25 nukleotider9) som ble tatt opp av menneskelig endotelceller. MiRNAs i EVs utgjør en stall med Ago2 (medlem av RNA-indusert silencing komplekse), som en gang levert til mottakeren celler, er spesielt stanse genuttrykk og påvirker barriereegenskaper av celler10. Standard protokoller er utviklet for å undersøke funksjon EVs. Her beskriver vi først en protokoll som tillater fluorescerende merkingen av EVs å undersøke deres opptak av mottakeren celler. I tillegg bruker en AC confocal mikroskop, er det mulig å spore den EV skjebne i cellen. Flere fluorescerende fargestoffer kan brukes til å spore EVs. Amin-reaktive dye, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) og Calcein-AM bli fluorescerende når inne blemmer. Vi foretrekker å bruke amphiphilic etiketten, PKH, fordi det gir et lysere og mer ensartet signal. Denne tilnærmingen gir viktig informasjon for å forstå samspillet mellom EVs og mottaker celler. Mens i noen tilfeller EVs binde på overflaten av cellene, er noen blemmer raskt tatt. Ved opptak levere EVs deres Last på cellene, der de utøve deres juridiske funksjoner.
Her beskriver vi en protokoll for å måle funksjonen barriere av endotelceller i vitro kvantifisere overføring av en fluorescerende dekstran gjennom en cellulær monolayer. Mer følsomme tracers kan brukes som radiolabeled markører. Men krever de spesielle sikkerhetsforanstaltninger for bruk. Andre analyser eksisterer for å måle barriere i vitro funksjonen som transendothelial elektrisk motstand (TEER), som måler tett krysset integritet. Endelig visualisere ZO-1, en tett krysset protein, av immunofluorescence kan vurdering av tett krysset integritet som vel10. Siden EVs er komplekse og heterogene enheter som inneholder flere skipslaster med potensielle regulatoriske karakteristiske, er det nyttig å overexpress en bestemt RNA å studere sin effekt på mottaker cellen. Derfor definere vi også en protokoll som mål å stabil cellelinjer uttrykke miRNA rundt10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere parasitter, inkludert Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania og Trichomonas utløse utgivelsen av EVs av infiserte vert cellen. Avhengig av patogener, kan de utgitte EVs modulerer immunrespons vert eller megle mobil kommunikasjon mellom parasitter6. Likevel er det lite bevis som tyder på hvordan disse små blemmer bidra til malaria sykdom. Her har vi beskrevet flere måter å undersøke funksjon EVs under Plasmodium infeksjon. For eksempel kan opptak av EVs av mottakeren celler i …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble økonomisk støttet delvis av Novartis grunnlaget for medisinsk og biologisk forskning (til PYM), av Gottfried og Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (til MW og PYM) og forskning pool av det katolske universitetet i Fribourg (til PYM). Flere tilskudd inkluderer den sveitsiske regjeringen Excellence stipender for utenlandske forskere (til KAB og SM). Vi takker Isabelle Fellay og Solange Kharoubi Hess for kundestøtte.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
Referências
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
