زيجوتيك Fluorescence الانتعاش بعد تبييض الصورة تحليل للارتخاء الكروماتين يتيح التنمية الكاملة ومدتها

Summary

يظهر الارتخاء الكروماتين أن تشارك في الإمكانات الإنمائية بلاستوميريس. ومع ذلك، لم يتضح ما إذا كان الارتخاء الكروماتين يمكن استخدامها كمؤشر موثوق لإمكانات النمو للأجنة. هنا، قد وصف نظام تجريبي التي يمكن أن تتطور الكروماتين zygotes تقييم الارتخاء لفترة كاملة.

Abstract

تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي. مؤخرا، ثبت أن تشارك في إمكانيات التمايز الخلوي للخلايا الجذعية الجنينية pluripotent الكروماتين الارتخاء أو الانفتاح. وذكر سابقا أن مقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، ميناء zygotes بنية الكروماتين خففت جداً، مما يوحي بارتباطها بما توتيبوتينسي. ومع ذلك، حتى الآن، قد لم تعالج عما إذا كان هذا الهيكل الكروماتين الغاية خففت/فتح مهم لإمكانات النمو الجنينية. في هذه الدراسة، ولدراسة هذه الفرضية، وضع نظام تجريبي في زيجوتيس التي التي تم تحليلها بواسطة الأسفار الانتعاش بعد تبييض الصورة يمكن أن تتطور إلى المدة دون أي أضرار كبيرة. الأهم من ذلك، يحتاج هذا النظام التجريبي فقط سخان الترمس-لوحة بالإضافة إلى المسح مجهر ليزر [كنفوكل]. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن الانتعاش الأسفار بعد تبييض الصورة تحليل التحليل (فراب) يمكن استخدامها للتحقيق في ما إذا كانت الأحداث الجزيئية في الكروماتين زيجوتيك هامان للتنمية الكاملة ومدتها.

Introduction

بعد الإخصاب، هو تغيير بنية الكروماتين بشكل حيوي، وهيكل الكروماتين زيجوتيك ثم أنشئت في نهاية المطاف^1،2. خلال هذه الفترة، والأب برونوكلي، يتم تغيير البروتين الكروماتين المهيمنة من البروتامين إلى هيستون. الكروماتين الناتجة من مختلف للغاية من الحيوانات المنوية وبويضات الإناث في عدة نقاط (مثلاً، التكوين البديل هستون، هستون تعديل). وهكذا، يعتقد الكروماتين زيجوتيك شكلت مهمة للتنمية الجنينية اللاحقة. ومع ذلك، وعلى الرغم من الجهود المبذولة للكشف عن تفاصيل هيكل الكروماتين زيجوتيك على مدى فترات طويلة، أساليب لتقييم نوعية زيجوتيس أو للتنبؤ بتنميتها الأجل الكامل في مرحلة واحدة-خلية عن طريق تحليل بنيتها الكروماتين لم تكن المنشأة.

في الدراسة السابقة، فهو اكتشف أن zygotes هيكل الكروماتين خففت الغاية³. في الوقت الراهن، يعتقد أن يكون عاملاً هاما في التمايز الخلوي المحتملة في الخلايا الجذعية الجنينية (ES)⁴الارتخاء الكروماتين أو الانفتاح. دإط الخلايا لا يحمل التجانس في الطبيعة، ولكن بدلاً من ذلك غير المتجانسة؛ في مستعمرات الخلايا دإط، اكتساب بعض عابر إمكانية تفريق أعلى يماثل blastomeres المرحلة اثنين خلايا الأجنة. خلال هذه المرحلة الانتقالية إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة، خلايا الكروماتين الارتخاء في وفاق التغييرات إلى ما قابل للمقارنة مع المرحلة اثنين خلايا الأجنة⁵. وهكذا، يبدو الارتخاء الكروماتين لتكون هامة لإمكانيات التمايز الخلوي وأنه من الممكن أن فتح الكروماتين على نطاق واسع في زيجوتيس مفيد لتقييم الإمكانات الإنمائية زيجوتيك.

تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي حيث يسمح هذا الأسلوب لذلك من تنمية وتطوير كامل المدة حتى⁶. وقد استخدمت تحليل فراب كأحد أساليب التصوير الحي، دراسة الارتخاء الكروماتين في الأجنة preimplantation وداط الخلايا^3،،من⁴⁵. إذا كان يمكن تحليل الارتخاء الكروماتين زيجوتيك دون أثر ضار على التنمية الكاملة ومدتها بتحليل فراب، قد يكون أداة قيمة لتقييم نوعية الأجنة في مرحلة واحدة-الخلية. ومع ذلك، قد لا درست آثار على التنمية على المدى الكامل بهذا الأسلوب التجريبي. مؤخرا، تم تطوير نظام تجريبي لاستخدام فراب لتقييم الارتخاء الكروماتين زيجوتيك. لأن هذا نظام جديد لمراقبة زيجوتيس، وقد وصفته فراب زيجوتيك (زفراب). زفراب لم تؤثر على التنمية على المدى الكامل خطيرة، وقد ذكرت في مكان آخر⁷. ويرد في هذا التقرير، البروتوكول هذا الأسلوب التجريبي.

Protocol

وأجرى هذه الدراسة يتفق بشكل صارم مع التوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجامعة ياماناشي. البروتوكول أقرته لجنة “أخلاقيات التجارب الحيوانية” من جامعة ياماناشي (تصريح رقم: A24-50). وأجريت جميع العمليات الجراحية تحت التخدير تريبروموثانول، وقد بذلت جميع الجهود للتقل?…

Representative Results

تحليل زفراب مع اجفب-H2B تنتج بشكل صحيح تم حقن مرناً ترميز H2B اجفب، الذي ينظر إليه بسبب عصابة تحول بولي تراجع (الشكل 2A)، في السيتوبلازم زيجوتيس مع جسم القطبي 2 في 1-3 ح بعد التلقيح (الشكل 2). 8 إلى 12 ح بعد التلقيح، زيج…

Discussion

تحليل زفراب كما اتضح في هذه الدراسة، لا يسبب الضرر الحرجة للتنمية على المدى الكامل، مما يوحي بهذا الأسلوب أداة مفيدة للغاية للكشف عن الرابطة بين الأحداث الجزيئية وإمكانية إنمائية الجنينية. أثناء إعادة برمجة، إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة دإط الخلايا، ومن خلالها إمكانيات تفضيلية لتلك ال?…

Materials

Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16