Zygotic fluorescens återhämtning efter foto-blekning analys för kromatin glapp som möjliggör fullgången utveckling
Summary
Kromatin glapp verkar vara inblandade i den utvecklande potentialen av blastomerer. Det är dock inte känt om kromatin glapp kan användas som en pålitlig index för den utvecklande potentialen för embryon. Här, har en experimentell system där kromatin glapp-utvärderas zygoter kan utvecklas till full sikt beskrivits.
Abstract
Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som möjliggör analys av molekylära händelser under ontogenin. Nyligen, kromatin glapp eller öppenhet har visat sig vara inblandade i celldifferentiering potential av pluripotenta embryonala stamceller. Det rapporterades tidigare som jämfört med embryonala stamceller, zygoter harbor en extremt lossade kromatinstruktur, tyder på associationen med deras totipotency. Men fram till nu, har det inte behandlats om denna extremt lossade/öppna kromatinstruktur är viktigt för embryonala utvecklingspotentialen. I den aktuella studien, för att pröva denna hypotes, utvecklades en experimentell system i vilka zygoter som analyserades av fluorescens återhämtning efter foto-blekning kan utvecklas till sikt utan betydande skada. Allt behöver detta experimentella system endast en termos-plattan värmare förutom en confocal laser skanning Mikroskop. Resultaten av denna studie föreslår att fluorescens återhämtning efter foto-blekning analys (FRAP) analys kan användas för att undersöka om de molekylära händelserna i zygotic kromatin är viktigt för fullgångna utveckling.
Introduction
Efter befruktningen, kromatinstruktur ändras dynamiskt, och zygotic kromatinstruktur är sedan så småningom etablerade1,2. Under denna period, i Faderns pronuclei, ändras proteinet dominerande kromatin från Protamin till Histon. Det resulterande kromatinet skiljer sig extremt från spermier och kvinnliga oocyter i flera punkter (t.ex., Histon variant sammansättning, Histon modifiering). Således tros bildade zygotic kromatin vara viktigt för efterföljande embryonal utveckling. Men trots ansträngningar att avslöja detaljerna i zygotic kromatinstrukturen under långa perioder, har metoder att utvärdera kvaliteten på zygoter eller att förutsäga deras fullgången utveckling i en-cellstadie genom att analysera deras kromatinstruktur aldrig varit etablerade.
I den tidigare studien upptäcks det att zygoter har en extremt lossade kromatin struktur3. För närvarande, tros kromatin glapp eller öppenhet vara en viktig faktor för celldifferentiering potential i embryonala stamceller (ES) celler4. ES-celler uppvisar inte homogenitet i naturen, men är ganska heterogen; i ES cell kolonier få vissa övergående en högre differentiering potential jämförbar med blastomerer två-cellstadie embryon. Under denna övergång in i två-cellen som stat, kromatin glapp i ES-celler förändringar i vad som är jämförbara med två-cellstadie embryon5. Kromatin glapp verkar således vara viktigt för celldifferentiering potential och det är möjligt att i stor utsträckning öppna kromatin i zygoter är användbart för utvärdering av zygotic utvecklingspotential.
Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som möjliggör analys av molekylära händelser under ontogenin eftersom denna metod möjliggör framtida utveckling och även fullgångna utveckling6. Som en av de levande avbildningsmetoder, har FRAP analys använts för att undersöka kromatin glapp i preimplantatorisk embryon och ES celler3,4,5. Om zygotic kromatin glapp kan analyseras utan en skadlig effekt på fullgångna utveckling av FRAP analys, kan det vara ett värdefullt verktyg för utvärdering av kvaliteten på embryon i en-cellstadie. Effekterna på fullgångna utvecklingen av denna experimentella metod har dock inte undersökts. Nyligen, en experimentell system använder FRAP för att utvärdera zygotic kromatin glapp utvecklades. Eftersom detta var ett nytt observationssystem för zygoter, var det betecknas som zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP påverkade inte kritiskt fullgången utveckling och har varit rapporterade någon annanstans7. I denna rapport beskrivs i protokollet av den experimentella metoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som framkommit i denna studie, orsakar den zFRAP analysen inte kritiska skador till fullgångna utveckling, tyder på att denna metod är ett mycket användbart verktyg för att avslöja sambandet mellan molekylära händelser och den embryonala utvecklingspotentialen. Under omprogrammering, in i två-cellen som stat av ES-celler, som differentiell potentialen i dessa celler blir lika hög som för två-cellstadie embryon, ändras kromatin glapp in i det jämförbara med två-cellstadie embryon5. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura och Kana Kishida för kritiska synpunkter och tekniska stöd. Detta arbete finansierades delvis av ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik programmet för att främja reformen av nationella universitet att M.O.; Japan Society för främjande av vetenskap (16H 02593), Asada Science Foundation och stiftelsen Takeda vetenskap att T.W. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
Referências
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
