JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Abstract

De genetische opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via amber stop codon onderdrukking is een krachtige techniek om te installeren van kunstmatige sondes en reactieve wordt op eiwitten rechtstreeks in de levende cel. Elke ncAA is verwerkt door een speciale orthogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) paar die is geïmporteerd in het ontvangende organisme. De efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs kan sterk verschillen, en in sommige gevallen ontoereikend. Orthogonale paren kunnen worden verbeterd door het manipuleren van de jaarlijkse Activiteitenverslagen van of het tRNA. Gerichte evolutie van tRNA of jaarlijkse Activiteitenverslagen met behulp van grote bibliotheken en dood/levend Selectiemethoden zijn echter niet haalbaar in zoogdiercellen. Hier, wordt een facile en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling aan de evaluatie van de doeltreffendheid van orthogonale paren in zoogdiercellen gepresenteerd. De bepaling kan screening van tientallen tot honderden varianten van de jaarlijkse Activiteitenverslagen/tRNA met een matige inspanning en binnen een redelijke termijn. Gebruik van deze test voor het genereren van nieuwe tRNAs die aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de orthogonale systeem van pyrrolysine wordt beschreven, samen met de toepassing van ncAAs aan de studie van de G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs), die zijn uitdagend objecten voor ncAA mutagenese. Ten eerste, door het systematisch opnemen van een foto-crosslinking ncAA gedurende het extracellulaire oppervlak van een receptor, bandplaatsen van verschillende liganden op de intact receptor worden toegewezen rechtstreeks in de levende cel. Ten tweede, door de integratie van ncAAs van de laatste generatie in een GPCR, ultrasnelle catalyst-gratis receptor labelen met een fluorescente kleurstof wordt aangetoond, die exploiteert bioorthogonal stam-bevorderd inverse Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) op de levende cel. Als ncAAs kan over het algemeen worden toegepast op elke proteïne onafhankelijk van de grootte, is de methode van algemeen belang voor een aantal toepassingen. Bovendien, ncAA opname niet vereist geen speciale apparatuur en gemakkelijk in standaard biochemie labs wordt uitgevoerd.

Introduction

De genetische opneming van chemische sondes in eiwitten is een krachtige methode om onderzoek van structurele en dynamische aspecten van eiwitfunctie rechtstreeks in de oorspronkelijke context van de levende cel. Tegenwoordig kunnen honderden niet-canonieke aminozuren (ncAAs) uitgerust met de meest uiteenlopende chemische groepen worden site-specifically opgenomen in eiwitten door biosynthese1,,2,,3,4. Tussen hen, vindt men lichtgevoelig ncAAs zoals foto-crosslinkers5, foto-caged,6,7,8,9 en foto-schakelbare aminozuren10, 11, aminozuren, rekening houdend met gespannen alkenen en alkynen voor catalyst-gratis bioorthogonal chemie2,12,13,14,15,16 ,17, uitvoering dansyl18en cumarine9,19prodan20,21 fluorophores aminozuren en aminozuren uitgerust met andere biofysische sondes als goed zoals met post vertalende wijzigingen1,2,3,4,22,23,24,25.

De genetische codering van een ncAA is ingeschakeld door een toegewijde amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) gekoppeld aan een cognaat suppressor-tRNA, waarin de ncAA in reactie op een amber stop codon tijdens de reguliere ribosomal synthese. ncAARS/tRNA paren zijn ontworpen zodanig orthogonale in het ontvangende organisme, dat wil zeggen niet cross-talk met de endogene paren. De techniek is goed ingeburgerd, zowel in de prokaryote en eukaryote hosts en gemakkelijk toepasbare aan zoogdieren cellen. Paren voor ncAA opneming in zoogdiercellen zijn gebaseerd op de drie belangrijkste orthogonale systemen: het tyrosyl-systeem, dat de TyrRS van E. coli26 met een suppressor tyrosyl amber van B. stearothermophilus27 (EG combineert TyrRS /BstYam paar), de E. coli leucyl systeem (EGLeuRS/tRNALeuCUA paar)6,18,28 en de archaeële pyrrolysyl systeem (PylRS/tRNA Pyl paar)3, waarbij het tRNAPyl is een natuurlijke amber suppressor. In het algemeen wordt elke ncAA herkend door een gespecialiseerde ncAARS. Afhankelijk van de structuur van de ncAA, wordt de ncAARS verkregen via gerichte evolutie van TyrRS, LeuRS of PylRS, hoewel sommige synthetases meer dan één ncAA kunnen aanvaarden.

Door eenvoudig met behulp van een plasmide vector wordt de orthogonale paar ingevoerd in de cellen. Meest voorkomende en efficiënte plasmiden zijn bicistronic en coderen van zowel voor de synthetase en de vorming van de orthogonale paar29tRNA. Een tweede plasmide-codering voor de proteïne van rentedragende een amber codon op de site voor wijziging aangewezen is mede-transfected. De ncAA is gewoon toegevoegd aan het groeimedium cel. Echter, verschillende gespecialiseerde clientgroepen gebruiken vaak verschillende varianten van plasmide constructies zelfs voor de opneming van de dezelfde ncAA. Constructies verschillen in de rangschikking van de genen in de vector, de aard van de synthetase, de codon gebruik in de synthetase gen, de promotor gebruik, de variant van het tRNA en aantal tRNA expressie cassettes. Bovendien kan de efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs drastisch variëren als gevolg van de verschillende katalytische efficiëntie van de verschillende synthetases, de kwaliteit van het tRNA, en andere factoren-30. Daarom is het belangrijk om bij de hand hebben een snelle en betrouwbare methode om te evalueren van de doeltreffendheid van een orthogonale paar, zowel om te kiezen van het meest geschikte systeem voor een gewenste toepassing en voor het uitvoeren van sommige optimization stappen dat verbetering van de algehele eiwit expressie opbrengsten.

We hebben een eenvoudige en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling om te evalueren van de doeltreffendheid van orthogonale paren29 (Figuur 1) opgericht. In de analyse, cellen zijn mede transfected met de plasmide-codering voor de orthogonale paar, samen met een bicistronic verslaggever plasmide codering zowel voor de groen fluorescente proteïne, rekening houdend met een amber stop codon op een tolerante positie (EGFPTAG) en de mCherry gen. Rode en groene fluorescentie van geheel-cel lysates worden gelezen in afzonderlijke kanalen op een afleesapparaat in een 96-wells-plaat. De intensiteit van de groene fluorescentie direct correleert met de efficiëntie van amber onderdrukking, overwegende dat de intensiteit van de rode fluorescentie een directe schatting van de grootte van het te meten monster en de efficiëntie van de transfectie geeft. Met betrekking tot soortgelijke testen op basis van fluorescentie voorlezen geassisteerde cell sorting (FACS)31,32, de bepaling geeft een onmiddellijke en uitgebreide beoordeling van eiwit expressie in de cel van de hele bevolking, die meer is representatief zijn voor de gebruikelijke proefomstandigheden, en biedt een eenvoudiger data acquisitie en verwerking met standaard software. Globaal, is het belangrijkste voordeel van de bepaling dat een middellange tot een groot aantal monsters kan worden geanalyseerd in parallel. Met behulp van deze test, hebben wij een rationeel ontworpen bibliotheek van suppressor-tRNAs ter verbetering van de efficiëntie van de Pyl orthogonale systeem30gescreend. Dit werk beschrijft het experimentele protocol om het uitvoeren van deze test en voorbeelden van de toepassing ervan, met inbegrip van de optimalisering van de orthogonale paar voor de opneming van de foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanine (Azi) en de vergelijking van de efficiëntie van de integratie van verschillende aminozuren (Figuur 2).

De laatste jaren heeft ncAA tools hebben bewezen zeer krachtig te onderzoeken van structurele en functionele aspecten van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34,35,,36,,37 , 38. bij de mens, GPCRs vormen een grote familie van membraan receptoren (800 leden) en hoofddoelen voor therapeutische drugs vertegenwoordigen. Directe structurele karakterisering van GPCRs is nog uitdagend en complementaire biochemische methoden zijn zeer nodig voor hun onderzoek. We hebben een pionier in het gebruik van foto-crosslinking ncAAs kaart GPCR oppervlakken en ontdek ligand bindende zakken34. Via ons geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw, wij stelselmatig Azi opgenomen in het domein van de hele juxtamembrane van een GPCR rechtstreeks in de cellen van levende zoogdieren. Bij UV-bestraling vormt Azi een zeer reactieve nitrene soorten die covalent naburige moleculen vangt. Wanneer de ligand wordt toegevoegd aan het systeem, fungeert Azi als een sonde van de nabijheid te onthullen welke posities van de receptor komen dicht bij de afhankelijke ligand. Op deze manier werd de bindende wijze van het neuropeptide hormoon Urocortin (Ucn1) op de klasse B GPCR corticotropin-releasing-factor receptor itype 1 (CRF1R)33 voor het eerst onthuld. De laatste tijd hebben we verschillende bindende patronen van agonisten en antagonisten op de dezelfde receptor38vermeld. Een soortgelijke aanpak is toegepast door anderen te onthullen van de orthosteric en allosteric bandplaatsen van andere peptides en klein molecuul liganden op andere GPCRs39,40,41,42. Dit manuscript beschrijft het experimentele protocol toegepast in ons lab voor foto-crosslinking toewijzing van GPCR oppervlakken. De methode is relatief snel, eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur, zodat zij is van toepassing in standaard biochemie labs. Nog belangrijker is, de aanpak biedt een waardevol instrument, niet alleen om te identificeren ligand bandplaatsen waar 3D Landeninformatie schaars zijn, maar ook ter aanvulling van de bestaande in vitro gegevens met informatie van volledig post-translationally gemodificeerde receptoren in de fysiologische omgeving van de levende cel.

De recente ontwikkeling van roman ncAAs invloed op de kant keten chemische groepen geschikt voor ultrasnelle katalysator-vrije bioorthogonal chemie heeft opengesteld van de mogelijkheid om te installeren van de laatste generatie fluorophores voor super-resolutie beeldvorming in eiwitten direct aan de levende cellen2,43. Dergelijke chemische ankers zijn gespannen cyclooctyne in SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17, en trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 onder andere ncAAs herbergen een Norborneen16,17,44 of cyclopropeen45,46 deel daarvan. Omvangrijk ncAAs voor de bioorthogonal scheikunde middels een variant van de PylRS meestal aangeduid als PylRSAF zijn opgenomen (die aangeeft mutatie Y271A en Y349F in de M. barkeri PylRS), maar ook door andere ad hoc geëvolueerd ncAARSs17 , 44. de ankers van bioorthogonal reageren met tetrazine reagentia47 via omgekeerde elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie geven hoge labeling opbrengsten binnen een paar minuten43,48. Toepassing van deze krachtige aanpak op etiket GPCRs heeft echter zijn uitdagend als gevolg van een lage algemene efficiëntie van de orthogonale ncAA opneming systeem. Via ons uitgebreide Pyl systeem, hebben we onlangs aangetoond hoog rendement opneming van dergelijke aminozuren in GPCRs en ultrasnelle GPCR etiketten op het oppervlak van levende cellen van zoogdieren30. Gelabelde receptoren waren nog steeds functioneel, als ze fysiologisch geïnternaliseerd bij het activeren van de receptor met een agonist. Het experimentele protocol voor de opneming van bioorthogonal ankers in GPCRs en labeling volgt worden hier beschreven. GPCRs met kleine heldere fluorophores om uit te rusten is de eerste essentiële stap naar de studie van GPCR structurele dynamica in de levende cel via geavanceerde microscopie technieken.

Protocol

1. fluorescentie gebaseerde Screening van opneming efficiencyverbeteringen (Figuur 1) Handhaven van HEK293 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle’s Medium (DMEM; hoge glucose, 4 mM glutamine, pyruvaat) aangevuld met 100 U/mL penicilline, 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO2. Zaad de cellen eergisteren transfectie. Loskoppelen van de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 0.05% tr…

Representative Results

De omtrek van de fluorescentie-bepaling is afgebeeld in Figuur 1. De bepaling is werkzaam in drie toepassingen. Op de eerste plaats, worden een aantal tRNA varianten voor opneming van Lys(Boc) door de Pyl orthogonale paar gescreend. Lys(BOC) is een sterically vergelijkbaar met Pyl aminozuur. Zoals Pyl niet commercieel beschikbaar is, wordt Lys(Boc) meestal gebruikt als een standaard substraat voor de PylRS. De afgeschermde tRNAs zijn gebaseerd op het tRNA<sup…

Discussion

Het protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare test om te beoordelen van de efficiëntie van orthogonale paren voor de opneming van ncAAs in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. Het belangrijkste voordeel van deze methode met betrekking tot de gebruikte testen op basis van FACS is dat het maakt het mogelijk gelijktijdig voorbereiding en meting van grotere aantallen monsters, en gegevens die gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van een gewone software levert. De beschikbaarheid van een middellange-doorvoer-…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk is opgericht door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onder subsidies CO822/2-1 (Emmy Noether programma) en CO822/3-1 I.C.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Bioquímica. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Química. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

Keywords: GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/pt/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image