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Química

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

Abstract

호박 정지 codon 억제를 통해 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs)의 유전 결합 인공 프로브 및 단백질에 반응 moieties 라이브 셀에 직접 설치 하는 강력한 기술입니다. 각 ncAA 호스트 유기 체로 가져온 전용된 직교 억압-tRNA/아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS) 쌍으로 통합 됩니다. 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다, 하 고 어떤 경우에 만족 될 수 있습니다. 직교 쌍은 AARS 또는 tRNA를 조작 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 그러나, tRNA 또는 AARS 큰 라이브러리를 사용 하 여 죽은/살아 선택 방법의 감독된 진화 되지 않습니다 가능한 포유류 세포에서. 여기, 손쉬운 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍 포유류 세포에서의 효율성을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 분석 결과 적당 한 노력으로 적절 한 시간 내 AARS/tRNA 변종의 수백 수만 심사 가능 Pyrrolysine 직교 시스템의 효율성을 크게 향상 시킬 새로운 tRNAs 생성 하는이 분석 결과의 사용 설명, G-단백질의 연구 ncAAs의 응용 프로그램과 함께 결합 수용 체 (GPCRs), 미식 축구에 대 한 개체에 도전 mutagenesis입니다. 첫째, 통합 하 여 체계적으로 수용 체의 세포 외 표면에 걸쳐 사진 가교 ncAA, 그대로 수용 체에 다른 ligands의 바인딩 사이트는 라이브 셀에 직접 매핑됩니다. 둘째는 GPCR에 마지막 세대 ncAAs를 통합 하 여 초고속 촉매 무료 수용 체는 형광 염료와 라벨 시연 되는 bioorthogonal 스트레인 승진 역 Diels 오리 나무 cycloaddition (SPIEDAC) 라이브 셀에 악용. NcAAs 크기에 독립적으로 어떤 단백질에 일반적으로 적용할 수 있는로 방법은 응용 프로그램의 수에 대 한 일반적인 관심의 이다. 또한, 번의 전미 대학 설립 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 쉽게 표준 생화학 실험실에서 수행 됩니다.

Introduction

단백질으로 화학 감지기의 유전 결합 구조와 동적 라이브 셀의 네이티브 컨텍스트에서 직접 단백질 기능 측면의 조사를 용이 하 게 하는 강력한 방법입니다. 요즘, 정식이 아닌 아미노산 (ncAAs) 가장 이질적인 화학 그룹으로 갖춰진 수백 수 있습니다 site-specifically 통합 단백질 생 합성1,2,,34. 서로 한 crosslinkers 사진5, 사진 갇힌6,7,,89 사진 전환 아미노산10, 등 사진에 민감한 ncAAs 발견 11, 아미노산 베어링 긴장 된 알 켄 및 촉매 무료 bioorthogonal 화학2,12,13,14,15,16 alkynes ,17, dansyl18,19coumarin9,및 prodan20,21 fluorophores, 운반 하는 아미노산 및 아미노산으로 다른 생물 프로브 장착 게시물 변환 수정1,2,3,4,22,23,,2425와 마찬가지로 잘.

유전자는 ncAA의 인코딩는 전용된 아미노-acyl-tRNA-합성 (AARS)는 동족 억압-tRNA, 일반 ribosomal 합성 중 황색 정지 codon에 번의 전미 대학 통합을 쌍으로 사용 됩니다. ncAARS/tRNA 쌍 호스트 유기 체, 즉 생 쌍 하지 잡담에에서 직교 수 있도록 설계 됩니다. 기술은 간결한 및 진 핵 호스트와 쉽게 적용 포유류 세포에서 잘 설립 이다. 포유류 세포에 있는 번의 전미 대학 설립에 대 한 쌍은 세 가지 주요 직교 시스템에 기반으로: B. stearothermophilus27 (Ec tyrosyl 호박 억압 대장균26 에서 TyrRS를 결합 하 여 tyrosyl 시스템 TyrRS /Bst참 마 쌍), 대장균 leucyl 시스템 (Ec그들/tRNA레이CUA 쌍)6,,1828 그리고 archaeal pyrrolysyl 시스템 (PylRS/tRNA Pyl 쌍)3, 그것에 의하여는 tRNAPyl 천연 호박 억압. 일반적으로, 각 ncAA 전문된 ncAARS에 의해 인식 된다. NcAA의 구조에 따라 일부 synthetases 이상의 ncAA를 받아들일 수 있지만 ncAARS TyrRS, 그들 또는 PylRS의 감독된 진화를 통해 얻어진 다.

직교 쌍 단순히 플라스 미드 벡터를 사용 하 여 셀에 가져오기 됩니다. 가장 일반적이 고 효율적인 플라스 미드는 bicistronic 하 고 모두는 합성 및 직교 쌍29를 형성 하는 tRNA를 인코딩합니다. 두 번째 플라스 미드 인코딩 수정에 대 한 지정 사이트에는 호박 codon 베어링 관심사의 단백질에 대 한 공동 transfected 이다. NcAA는 단순히 셀 성장 매체에 추가 됩니다. 그러나, 다른 전문된 그룹 종종 같은 ncAA의 설립에도 플라스 미드 구조물의 다른 이체를 사용합니다. 구문을 벡터은 합성 유형의 합성 유전자, 발기인 사용, tRNA와 tRNA 식 카세트의 수의 변종에 codon 사용법에 유전자의 배열에서 다르다. 또한, 다른 ncAAs의 관 효율 크게 다른 synthetases, tRNA, 및 다른 요인30의 품질의 다른 촉매 효율성으로 인해 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 손에 원하는 응용 프로그램에 대 한 가장 적합 한 시스템을 선택 하 고 전체 단백질 식이 개선 하는 몇 가지 최적화 단계를 수행 하는 직교 쌍의 효율성을 평가 하는 신속 하 고 안정적인 방법을 갖는 것이 중요 생성합니다.

우리는 간단 하 고 강력한 형광 기반 분석 결과 직교 쌍29 (그림 1)의 효율성을 평가 하기 위해 설립. 분석 결과, 세포는 플라스 미드 인코딩을 모두 허용 위치 (EGFP태그)에 황색 정지 codon를 베어링 녹색 형광 단백질에 대 한 인코딩 bicistronic 기자 플라스 미드와 직교 쌍에 대 한 공동 transfected와 mCherry 유전자입니다. 전체 세포 lysates의 빨강과 녹색 형광 96 잘 접시에서 플레이트 리더에 별도 채널에서 읽혀집니다. 빨간 형광의 강도 측정된 샘플 크기 transfection 효율의 직접적인 견적 제공 하는 반면 녹색 형광의 강도 직접 호박 억제의 효율성과 상관 한다. 형광에 따라 유사한 분석 실험에 관하여 보조 셀 정렬 (FACS) 읽기31,32, 밖으로 더 전체 세포 인구에 단백질 식의 즉각적이 고 포괄적인 평가 제공 하는 분석 결과 일반적인 실험 조건의 대표는 쉽게 데이터 수집 및 처리 표준 소프트웨어를 제공 합니다. 전반적으로, 분석 결과의 주요 장점은 샘플의 다 수 매체 동시에 분석할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 억압-tRNAs Pyl 직교 시스템30의 효율성을 개선 하기 위해 합리적으로 설계 된 도서관을 상영 했습니다. 이 작업 수행이 분석 결과 사진-가교 ncAA p-azido-L-페닐알라닌 (매)의 설립에 대 한 직교 쌍의 최적화와의 비교를 포함 하 여 그 응용 프로그램의 예를 보여을 실험 프로토콜을 설명 합니다. 다른 아미노산 (그림 2)의 법인 효율성

지난 년 동안 ncAA 도구 구조를 조사 하기 위해 매우 강력한 입증 된 및 기능적 측면의 G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs)33,34,35,,3637 , 38. 인간, GPCRs 막 수용 체 (800 명)의 대 가족을 형성 하 고 치료 약물에 대 한 주요 목표를 나타냅니다. GPCRs의 직접 구조 특성 아직도 도전 이며 보완적인 생 화 확 적인 방법 그들의 조사에 필요한 높은. 우리 사진 가교 ncAAs GPCR 표면 지도 ligand 바인딩 주머니34를 발견 하 고의 사용을 개척 했습니다. 체계적으로 라이브 포유류 세포에서 직접 GPCR의 전체 juxtamembrane 도메인에 걸쳐 매를 통합 매 관에 대 한 최적화 된 시스템을 사용 하 여, 우리. UV 조사에 따라 매를 covalently 이웃 분자 반응성이 매우 높은 nitrene 종 형성. 리간드를 시스템에 추가 될 때 매 근접 프로브는 수용 체의 위치는 바인딩된 ligand 가까이 서 공개를 제공 합니다. 이 방법에서는, Urocortin (Ucn1) 클래스 B GPCR corticotropin 풀어-팩터 수용 체에 입력 1 (CRF1R)33 neuropeptide 호르몬의 바인딩 모드 처음 공개 됐다. 최근에, 우리는 촉진제와38동일한 수용 체 길 항 근의 고유한 바인딩 패턴 공개는. 유사한 접근은 orthosteric와 다른 펩 티 드 및 다른 GPCRs39,40,,4142에 작은 분자 ligands의 allosteric 바인딩 사이트에 다른 사람에 의해 적용 되었다. 이 원고는 GPCR 표면 사진 가교 매핑에 대 한 우리의 실험실에서 적용 실험 프로토콜을 설명 합니다. 메서드는 비교적 빠르고, 간단 하 고 표준 생화학 실험실에 적용 되도록 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다. 중요 한 것은, 접근 제공 뿐만 아니라 ligand 바인딩 사이트 3D 구조 데이터 부족, 식별 뿐만 아니라 기존의 체 외에 데이터에 post-translationally 완전히 수정 된 수용 체에서 정보를 보완 하기 위해 유용한 도구는 살아있는 세포의 생리 적인 환경입니다.

소설 ncAAs 측면 체인 화학 그룹 초고속 촉매 무료 bioorthogonal 화학에 대 한 적합 한 베어링의 최근 개발은 단백질으로 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 마지막 세대 fluorophores 설치 가능성 열었다 라이브에 직접2,43세포. 이러한 화학 앵커 포함 긴장된 cyclooctyne SCOK14, BCNK12,17, bicyclo [6.1.0] nonyne 및 TCO에 트랜스-cyclooctenes * 다른 ncAAs 중 K13,,1517 norbornene16,17,44 또는 cyclopropene45,46 moiety 은닉. 일반적으로 PylRSAF 로 표시 하는 PylRS의 변형에 의해 부피가 ncAAs bioorthogonal 화학에 대 한 통합 (돌연변이 나타내는 Y271A와 Y349F M. barkeri PylRS에), 뿐만 아니라 다른 임시 진화 ncAARSs17 에 의해 , 44. bioorthogonal 앵커 tetrazine 시 약47 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 몇 분43,48내 높은 라벨 수익률을 제공을 통해 반응. 그러나, 레이블을 GPCRs이 강력한 방법의 응용 프로그램 직교 ncAA 법인 시스템의 낮은 전반적인 효율성 때문 도전 하고있다. 우리의 향상 된 Pyl 시스템을 사용 하 여, 우리 최근 GPCRs 및 초고속 GPCR30라이브 포유류 세포 표면에 라벨에 같은 아미노산의 높은 수율 설립을 증명 하고있다. 레이블이 지정 된 수용 체 그들은 생리 적으로 길 항 제와 수용 체 활성화에 따라 내 면 여전히 작동 했다. Bioorthogonal의 설립에 대 한 실험 프로토콜 GPCRs로 고정 하 고 라벨 다음과 설명. 작은 밝은 fluorophores GPCRs 장비 고급 현미경 기술을 통해 라이브 셀에서 GPCR 구조 역학의 연구 향한 첫 기본 단계입니다.

Protocol

1. 형광 기반 심사 관 효율성 (그림 1)의 Dulbecco의 수정이 글의 중간에 HEK293 세포 유지 (DMEM; 높은 포도 당, 4mm 글루타민, pyruvate) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린, 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 100 µ g/mL 스 보완. 씨 셀 transfection 전날입니다. 트립 신/PBS 0.5 m EDTA 보충 0.05%에서 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 분리 합니다. 1 mL 트립 신/EDTA를 ?…

Representative Results

형광 분석 결과의 개요는 그림 1에 묘사 된다. 분석 결과 세 가지 응용 프로그램에서 채택 된다. 첫 번째 장소에서 tRNA 변종 Pyl 직교 쌍에 의해 Lys(Boc)의 설립에 대 한 수는 상영 된다. Lys(Boc)은 sterically Pyl 유사 아미노산. Pyl 상용으로, Lys(Boc)는 일반적으로 PylRS에 대 한 표준 기판으로 사용. tRNA를 기반으로하는 스크린된 tRNAsPyl. 각 tRNA 변형을 단?…

Discussion

프로토콜에는 포유류 세포에 표현 된 단백질으로 ncAAs의 설립에 대 한 직교 쌍의 효율성을 평가 하기 위해 간단 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과를 설명 합니다. FACS에 따라 널리 사용 되는 분석 실험에이 방법의 주요 장점은 동시 준비 및 샘플의 더 많은 수의 측정을 쉽게 일반 소프트웨어를 사용 하 여 분석 데이터를 제공 합니다. 포유류 세포에서 직교 쌍을 분석 하는 중간 처리 방법의 가용성은 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품에서 CO822/2-1 (에 미 뇌터 프로그램) 및 CO822/3-1 I.C. 보조금 도이치 가운데 (DFG)에 의해 설립 되었습니다.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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Referências

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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