En lettvinte fluorescens analysen er presentert for å evaluere effektiviteten av amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA omfatter ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i proteiner i pattedyrceller. Bruk av ncAAs å studere G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) er beskrevet, inkludert Foto-crosslinking tilordning av bindende områder og bioorthogonal GPCR merking på levende celler.
Genetisk inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via rav stopp codon undertrykkelse er en kraftfull teknikk installere kunstige sonder og reaktive moieties på proteiner direkte i live cellen. Hver ncAA er innarbeidet med en dedikert ortogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) par som importeres inn i verten organisme. Inkorporering effektiviteten av forskjellige ncAAs varierer sterkt, og være tilfredsstillende i noen tilfeller. Ortogonale par kan forbedres ved å manipulere AARS eller i tRNA. Men regissert utviklingen av tRNA eller AARS store biblioteker og døde/levende utvalg metoder er ikke gjennomførbart i pattedyrceller. Her vises en lettvinte og robust fluorescens-baserte analysen å evaluere effektiviteten av ortogonale par i pattedyrceller. Analysen kan screening titalls til hundrevis av AARS/tRNA varianter med en moderat innsats og innen rimelig tid. Bruk av denne analysen til å generere nye tRNAs som forbedrer effektiviteten av pyrrolysine ortogonale betydelig er beskrevet, sammen med bruk av ncAAs til studiet av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs), som er utfordrende objekter for ncAA mutagenese. Først, ved å systematisk innlemme en foto-crosslinking ncAA gjennom ekstracellulære overflaten av en reseptor, bindende områder av forskjellige ligander på intakt reseptoren tilordnes direkte i live cellen. Andre, ved å innlemme siste generasjons ncAAs i en GPCR, lynraske katalysator-fri reseptor merking med et fluorescerende farge er bevist, som utnytter bioorthogonal belastning forfremmet omvendt Diels or cycloaddition (SPIEDAC) på den levende cellen. Som ncAAs kan generelt brukes til alle protein i størrelse, er metoden av generell interesse for en rekke applikasjoner. I tillegg ncAA innlemmelse krever ikke spesialutstyr og utføres enkelt i standard biokjemi laboratorier.
Genetisk inkorporering av kjemiske sonder i proteiner er en kraftig metode å lette etterforskningen av strukturelle og dynamisk aspekter av protein funksjonen direkte i opprinnelige kontekst av levende celle. I dag, kan hundrevis av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) utstyrt med de mest ulike kjemiske gruppene site-specifically innlemmet i proteiner av biosyntesen1,2,3,4. Mellom dem, finner man Foto-sensitive ncAAs som Foto-crosslinkers5, foto-bur6,7,8,9 og foto-valgbar aminosyrer10, 11, aminosyrer anstrengt alkener og alkynes for katalysator-fri bioorthogonal kjemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyrer bærer dansyl18, kumarin9,19og prodan20,21 fluorophores og aminosyrer utstyrt med andre Biofysiske sonder som godt som med innlegg translasjonsforskning modifikasjoner1,2,3,4,22,23,24,25.
Genetiske kodingen av en ncAA aktiveres som en dedikert amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) koblet til en beslektet suppressor-tRNA, som inkorporerer ncAA svar på en gul stopp codon under vanlige ribosomal syntese. ncAARS/tRNA par er konstruert for å være ortogonale i verten organisme, altså ikke cross-talk med endogene parene. Teknikken er godt etablert både i prokaryotic og eukaryotic verter og lett gjelder pattedyr celler. Par for ncAA innlemmelse i pattedyrceller er basert på tre viktigste ortogonale systemer: tyrosyl systemet, som kombinerer TyrRS E. coli26 med en tyrosyl rav suppressor fra B. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstYam par), E. coli leucyl system (EcLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 og archaeal pyrrolysyl system (PylRS-tRNA- Pyl par)3, der tRNAPyl er en naturlig rav suppressor. Generelt, gjenkjennes hver ncAA av en spesialisert ncAARS. Avhengig av ncAA struktur, er ncAARS innhentet via regissert utviklingen av TyrRS, LeuRS eller PylRS, selv om noen synthetases kan godta flere ncAA.
Ortogonale paret importeres inn i cellene ved å bruke en plasmider vektor. Mest vanlige og effektive plasmider er bicistronic og kode både i synthetase og tRNA danner ortogonale par29. En andre plasmider koding for protein av rentebærende et gult codon på stedet angitt for endring er co transfekterte. NcAA legges bare til celle vekst medium. Imidlertid bruker forskjellige spesialiserte grupper ofte ulike varianter av plasmider konstruksjoner for inkorporering av samme ncAA. Konstruksjoner varierer i ordningen av gener i vektor, type av synthetase, codon bruk i synthetase genet, formidler bruk, variant av tRNA og antall tRNA uttrykk kassetter. Videre kan innlemmelse effektiviteten av forskjellige ncAAs variere drastisk på grunn av ulike katalytisk effektiviteten av de forskjellige synthetases, kvaliteten på tRNA og andre faktorer30. Derfor er det viktig å ha på hånden en rask og pålitelig metode for å vurdere effektiviteten av et ortogonale par, både å velge det mest passende systemet for et ønsket program og utføre noen optimering skritt som forbedrer generell protein uttrykk gir.
Vi har etablert en enkel og robust fluorescens-baserte analysen for å evaluere effektiviteten av ortogonale par29 (figur 1). I analysen, cellene er co transfekterte med plasmider koding for ortogonale paret, sammen med en bicistronic reporter plasmider koding både for grønne fluorescerende protein bærer en gul stopp codon på en ettergivende posisjon (EGFPTAG) og mCherry gene. Rød og grønn fluorescens av hele celler lysates leses i separate kanaler på en plate leser i en 96-brønns plate. Intensiteten av den grønne fluorescensen direkte korrelerer med effektiviteten av rav undertrykkelse, mens intensiteten av rød fluorescens gir en direkte anslag over størrelsen på målt prøven og transfection effektiviteten. Med hensyn til lignende analyser basert på fluorescens lese assistert celle sortering (FACS) ut31,32, analysen gir en umiddelbar og omfattende vurdering av protein uttrykk i befolkningen hele cellen, som er mer representant for vanlige eksperimentelle forhold, og tilbyr en enklere datainnsamling og prosessering programvare. Samlet er den største fordelen med analysen som et medium til et stort antall prøver kan bli analysert i parallell. Bruker denne analysen, har vi vist et rasjonelt utformet bibliotek med suppressor-tRNAs for å effektivisere Pyl ortogonale systemet30. Dette verket beskriver eksperimentelle protokollen for å utføre denne analysen og viser eksempler på programmet, inkludert optimalisering av ortogonale paret inkorporering av den Foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanin (Azi) og sammenligning av inkorporering effektiviteten av ulike aminosyrer (figur 2).
De siste årene, ncAA verktøy har vist seg svært kraftig undersøke strukturelle og funksjonelle aspekter av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs),33,,34,,35,,36,,37 , 38. hos mennesker, GPCRs danner en stor familie membran reseptorer (800 medlemmer) og representerer viktigste mål for terapeutisk narkotika. Direkte strukturelle karakterisering av GPCRs er fortsatt utfordrende og komplementære biokjemiske metoder er svært nødvendig for etterforskningen. Vi har banebrytende bruk av foto-crosslinking ncAAs kartet GPCR overflater og oppdage ligand binding lommer34. Bruker systemet vårt er optimalisert for Azi innlemmelse, innlemmet vi systematisk Azi gjennom hele juxtamembrane domenet for en GPCR direkte i live pattedyrceller. På UV bestråling danner Azi en svært reaktive nitrene arter som covalently fanger nærliggende molekyler. Når ligand legges til systemet, fungerer Azi som en nærhet sonde å avsløre posisjoner av reseptoren komme nær bundet ligand. På denne måten ble bindingsmodus av neuropeptide hormone Urocortin jeg (Ucn1) på klasse B GPCR corticotropin-slippe-faktor reseptoren type 1 (CRF1R)33 først lansert. I det siste har vi avslørte distinkte bindende bruksmønstre agonister og motstanderne på det samme reseptor38. En lignende tilnærming har blitt brukt av andre å avsløre orthosteric og allosteric bindende områder av andre peptider og små molekyl ligander på andre GPCRs39,40,41,42. Dette manuskriptet beskriver eksperimentelle protokollen anvendt i vår lab for foto-crosslinking tilordning av GPCR overflater. Metoden er relativt rask, enkel og krever ikke spesielt utstyr, slik at det er aktuelt i standard biokjemi laboratorier. Viktigere, tilnærmingen gir et verdifullt verktøy ikke bare å identifisere ligand binding områder der 3D strukturelle data er mangelvare, men også å komplettere eksisterende i vitro data med informasjon fra fullt post-translationally endret reseptorer i den fysiologiske miljø i live cellen.
Den siste utviklingen av romanen ncAAs betydning siden kjeden kjemiske gruppene egner for superrask katalysator-fri bioorthogonal kjemi har åpnet opp muligheten til å installere siste generasjons fluorophores for super-oppløsning bildebehandling i proteiner direkte på live celler2,43. Slike kjemiske ankere inneholde anstrengt cyclooctyne i SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, og trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 blant andre ncAAs skjuler en norbornene16,17,44 eller cyclopropene45,46 moiety. Store ncAAs i bioorthogonal kjemi er innlemmet ved en variant av PylRS vanligvis merket som PylRSAF (som angir mutasjon Y271A og Y349F i M. barkeri PylRS), så vel som av andre ad hoc utviklet ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankere reagere med tetrazine reagenser47 via omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition å gi høy merking avkastning innen et par minutter43,48. Men har anvendelsen av denne kraftige tilnærmingen til etiketten GPCRs vært utfordrende på grunn av en lav virkningsgraden i ortogonale ncAA innlemmelse systemet. Bruke vår forbedrede Pyl system, har vi nylig vist høy dekkevne innlemmelse av slike aminosyrer i GPCRs og lynraske GPCR merking på overflaten av live pattedyrceller30. Merket reseptorer var fremdeles funksjonell, som de fysiologisk internalisert på aktivere reseptoren med en Agonistiske. Eksperimentell protokollen for inkorporering av bioorthogonal plugger i GPCRs og merking følgende beskrives her. Utstyre GPCRs med små lyse fluorophores er det første grunnleggende skrittet mot studiet av GPCR strukturelle dynamikken i live cellen via avanserte mikroskopi teknikker.
Protokollen beskriver en enkel og pålitelig analysen for å vurdere effektiviteten av ortogonale for inkorporering av ncAAs proteiner i pattedyrceller. Den største fordelen med denne metoden gjelder brukte analyser basert på FACS er at det tillater samtidig forberedelse og måling av større antall prøver, og gir data som analyseres enkelt ved hjelp av en vanlig programvare. Tilgjengeligheten av en medium gjennomstrømming metode for å analysere ortogonale par i pattedyrceller er svært viktig for utviklingen av nye…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er grunnlagt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under tilskudd CO822/2-1 (Emmy-Noether program) og CO822/3-1 til IC
Chemicals | |||
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) | Carl Roth | 3029.1 | |
Ammonium persulfate (APS) | Carl Roth | 9592.2 | |
p-Azidophenylalanine (Azi) | Bachem | F-3075.0001 | |
Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | |
Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Bovine serum albumine (BSA) | Carl Roth | 8076.2 | |
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) | NovaBiochem | 8540430100 | |
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) | Sichem | SC-8000 | |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
DTT | Carl Roth | 6908.1 | |
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) | home-made | 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal] | |
EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.1 | |
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) | Sichem | SC-8014 | |
FBS | Thermo Fisher (Gibco) | 10270106 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher (Gibco) | A1896701 | |
Glycerol | Carl Roth | 7533.1 | |
Glycin | Carl Roth | 3908.3 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
KCl | Carl Roth | 6781.3 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668019 | |
Luminol | Applichem | A2185,0005 | |
Methanol | Carl Roth | 0082.3 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.2 | |
NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
Na-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
NaOH | Grüssing | 121551000 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
p-Coumaric acid | Sigma-Aldrich | C9008-1G | |
poly-D-lysine hydrobromide | Corning | 354210 | |
PEI | Polysciences | 23966 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher (Gibco) | 11548876 (15140-122) | |
PMSF | Carl Roth | 6367.1 | |
PNGase F | NEB | P0704L | |
Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | |
PVDF membrane Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
Skim Milk Powder | Sigma | 70166 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Carl Roth | CN30.2 | |
Tetrazine-Cy3 | Jena Bioscience | CLK-014-05 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | |
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) | Sichem | SC-8008 | |
TRIS | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
Trypsin 2.5% | Thermo Fisher (Gibco) | 15090046 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.2 | |
Wasserstoffperoxid (30%) | Merck | 1.07210.0250 | |
Cell lines | |||
HEK293 cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-305 | |
HEK293T cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-635 | |
Equipment | |||
Crosslinker Bio-Link 365 nm | Bio-Budget Technologies GmbH | 40-BLX-E365 | 5 x 8 Watt tubes |
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega | BMG LABTECH | ||
Plasmids | |||
Plasmid E2AziRS | The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) | Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter | |
POI-TAG mutant plasmids | Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position | ||
CRF1R-95TAG-EGFP | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | ||
HA-PTH1R-79TAG-CFP | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | ||
Arrestin3-FLAG | Synthesized by Genart (Life Technologies) | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | |
Antibodies | |||
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate | Sigma-Aldrich | A8592 | monoclonal, produced in mouse clone M2 |
Goat-anti-rabbit-HRP antibody | Santa Cruz | sc-2004 | |
Rabbit-anti-CRF antibody | home-made | PBL #rC69 | polyclonal [Turnbull] |
Rabbit-anti-Ucn1 antibody | home-made | PBL #5779 | polyclonal [Turnbull] |