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Química

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Abstract

A incorporação genética de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) através da supressão de códon de parada âmbar é uma técnica poderosa para instalar sondas artificiais e partes reativas para proteínas diretamente na célula viva. Cada ncAA é constituída por um dedicado ortogonais supressor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) par que é importado para o organismo hospedeiro. A eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode extremamente diferentes e insatisfatória, em alguns casos. Ortogonais pares podem ser melhoradas através da manipulação ou da raa ou o tRNA. No entanto, evolução dirigida de tRNA ou AARS usando grandes bibliotecas e métodos de seleção mortos/vivos não são viáveis em células de mamíferos. Aqui, apresenta-se um ensaio facile e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência de pares ortogonais em células de mamíferos. O ensaio permite a seleção de dezenas a centenas de variantes de RAA/tRNA com um esforço moderado e dentro de um prazo razoável. Uso deste teste para gerar novos tRNAs que melhoram significativamente a eficiência do sistema ortogonal Pirrolisina é descrito, juntamente com a aplicação de ncAAs ao estudo da proteína G acoplados receptores (GPCRs), que são difíceis de objetos para o ncAA mutagênese. Em primeiro lugar, incorporando sistematicamente uma foto-reticulação ncAA em toda a superfície extracelular de um receptor, locais obrigatórios de ligantes diferentes no receptor intacto são mapeados diretamente na célula viva. Segundo, incorporando ncAAs de última geração para um GPCR, ultra rápida do receptor livre de catalisador etiquetando com uma tintura fluorescente é demonstrado, que explora o opaco promovido a tensão inversa Diels-Alder cicloadição (SPIEDAC) sobre a célula viva. Como ncAAs pode geralmente ser aplicado para qualquer proteína, independentemente de seu tamanho, o método é de interesse geral para um número de aplicações. Além disso, a incorporação de ncAA não exige qualquer equipamento especial e é facilmente realizada em laboratórios de bioquímica padrão.

Introduction

A incorporação genética de sondas químicas em proteínas é um método poderoso para facilitar a investigação dos aspectos estruturais e dinâmicos da função da proteína diretamente no contexto nativo da célula ao vivo. Hoje em dia, centenas de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) equipados com os mais diferentes grupos químicos podem ser site-specifically incorporadas em proteínas de biossíntese1,2,3,4. Entre eles, reencontra-se foto-sensível ncAAs como crosslinkers-foto5, foto-enjaulado6,7,8,9 e foto-comutável aminoácidos10, 11, ácidos aminados, tendo tensas alcenos e alcinos por catalizador-livre opaco química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos carregando dansyl18, cumarina9,19e prodan20,21 fluorophores e aminoácidos equipados com outras sondas biofísicas como bem como com post modificações translacionais1,2,3,4,22,23,24,25.

A codificação genética de um ncAA é ativada por um dedicado amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) emparelhado com um supressor-tRNA cognato, que incorpora a ncAA em resposta a um codão stop âmbar durante a síntese ribossomal regular. pares de ncAARS/tRNA são projetados para serem ortogonais no organismo hospedeiro, ou seja, não a Cruz-conversa com os pares endógenos. A técnica é bem estabelecida, tanto em procariontes e eucariontes hospedeiros e células facilmente aplicáveis aos mamíferos. Pares para a incorporação da ncAA em células de mamíferos são baseados em três principais sistemas ortogonais: sistema de correntes, que combina o TyrRS de e. coli26 com um supressor de correntes âmbar de b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / par deBstYam), o sistema (parCELeuRS/tRNALeuCUA ) Escherichia coli de leucyl6,18,28 e o sistema de pyrrolysyl de Archaea (PylRS/tRNA Pyl par)3, pelo qual o tRNAPyl é um supressor natural de âmbar. Em geral, cada ncAA é reconhecido por um ncAARS especializado. Dependendo da estrutura do ncAA, a ncAARS é obtido através de uma evolução dirigida de LeuRS, TyrRS ou PylRS, embora algumas sintetases podem aceitar mais de um ncAA.

O par ortogonal é importado para as células simplesmente usando um vetor do plasmídeo. Mais comuns e eficientes plasmídeos são bicistronic e codificam para a sintetase e o tRNA formando o par ortogonais29. Um plasmídeo segundo a codificação da proteína de interesse, tendo um códon âmbar no local designado para a modificação é co transfectada. O ncAA é simplesmente adicionado ao meio de crescimento de célula. No entanto, diferentes grupos especializados muitas vezes usam diferentes variantes do plasmídeo construções mesmo para a incorporação do ncAA mesmo. Construções diferem no arranjo dos genes no vetor, tipo da sintetase, uso de códon no gene da sintetase, uso do promotor, variante do tRNA e número de fitas de expressão do tRNA. Além disso, a eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode variar drasticamente devido a eficiência catalítica diferente dos sintetases diferentes, a qualidade do tRNA e outros fatores30. Portanto, é importante ter à mão um método rápido e confiável para avaliar a eficiência de um par de ortogonal, para escolher o sistema mais adequado para uma aplicação desejada e para executar algumas etapas de otimização que melhoram a expressão de proteínas totais rendimentos.

Nós estabelecemos um ensaio simples e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência dos pares ortogonais29 (Figura 1). No ensaio, as células são co transfectadas com o plasmídeo de codificação para o par ortogonal, juntamente com um plasmídeo do repórter bicistronic codificação tanto para a proteína verde fluorescente, tendo um códon âmbar parada em uma posição permissiva (EGFPTAG) e o gene mCherry. Vermelha e verde fluorescência da célula inteira lysates são lidos em canais separados em um leitor de placa em uma placa de 96 poços. A intensidade da fluorescência verde correlaciona diretamente com a eficiência da supressão de âmbar, Considerando que a intensidade da fluorescência vermelha dá uma estimativa direta do tamanho da amostra medida e a eficiência do transfection. No que diz respeito a ensaios semelhantes baseados em fluorescência assistida célula classificação (FACS) ler31,,32, o ensaio dá uma avaliação imediata e abrangente da expressão da proteína da população celular, que é mais representativo das condições experimentais habituais e oferece uma fácil aquisição de dados e processamento com software padrão. Em geral, a principal vantagem do ensaio é que um meio para um grande número de amostras pode ser analisado em paralelo. Usando este ensaio, tem exibido uma biblioteca racionalmente concebida de supressor-tRNAs para melhorar a eficiência do sistema ortogonal Pyl30. Este trabalho descreve o protocolo experimental para executar este ensaio e mostram exemplos de sua aplicação, incluindo a otimização do par ortogonal para a incorporação da foto-reticulação ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e a comparação de eficiências de incorporação de aminoácidos diferentes (Figura 2).

Nos últimos anos, foram comprovadas ferramentas ncAA muito poderosas para investigar estrutural e aspectos funcionais da proteína G acoplados a receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. em humanos, GPCRs formam uma grande família de receptores de membrana (800 membros) em representam os principais alvos para drogas terapêuticas. Caracterização estrutural direta de GPCRs é ainda um desafio e métodos bioquímicos complementares são altamente necessários para sua investigação. Nós temos pioneira no uso de foto-reticulação ncAAs para mapear as superfícies GPCR e descubra ligante vinculação bolsos34. Usando nosso sistema otimizado para incorporação de Azi, incorporamos sistematicamente Azi em todo o domínio de toda juxtamembrane de um GPCR diretamente em células de mamíferos vivas. Após irradiação UV, Azi forma uma espécie de nitrene altamente reativos que capta covalentemente a moléculas vizinhas. Quando o ligante é adicionado ao sistema, Azi serve como uma sonda de proximidade para revelar quais as posições do receptor vem perto do ligante ligado. Desta forma, o modo de ligação do hormônio neuropeptídeo Urocortin (Ucn1) no receptor da classe B GPCR corticotropin-liberando-fator digito 1 (CRF1R)33 foi primeiramente revelado. Ultimamente, nós temos divulgados padrões distintos de ligação dos agonistas e antagonistas sobre o mesmo receptor38. Uma abordagem semelhante foi aplicada por outros para revelar orthosteric e sítios de ligação alostéricos de outros peptídeos e ligantes pequena molécula em outros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito descreve o protocolo experimental aplicado em nosso laboratório para foto-reticulação mapeamento de superfícies GPCR. O método é relativamente rápido, simples e não requer nenhum equipamento especial, para que seja aplicável em laboratórios de bioquímica padrão. Importante, a abordagem fornece uma ferramenta valiosa não apenas para identificar sites de ligação do ligante onde dados estruturais 3D são escassos, mas também para complementar o existente em vitro dados com informações de receptores post-translationally totalmente modificadas na ambiente fisiológico da célula ao vivo.

O desenvolvimento recente do romance ncAAs rolamento sobre os lado da cadeia grupos químicos apropriados para ultra livre de catalisador opaco química abriu a possibilidade de instalar fluorophores de última geração para a imagem latente de super-resolução nas proteínas diretamente sobre o live células2,43. Tais âncoras químicas incluem cyclooctyne tensa em SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne na BCNK12,17e trans-cyclooctenes no TCO * K13,15,17 , entre outros ncAAs abrigando um norbornene16,17,44 ou,ciclopropeno4546 moiety. NcAAs volumosos para opaco química são incorporados por uma variante do PylRS geralmente denotado como PylRSAF (indicando a mutação Y271A e Y349F em M. barkeri PylRS), bem como por outras ad hoc evoluído ncAARSs17 , 44. as âncoras opaco reagem com reagentes de tetrazine47 via cicloadição de Diels-Alder elétron-demanda inversa para dar altos rendimentos rotulagem dentro de alguns minutos,43,48. No entanto, aplicação desta abordagem poderosa para rótulo GPCRs tem sido desafiador devido a uma baixa eficiência global do sistema ortogonal de incorporação da ncAA. Usando o nosso avançado sistema de Pyl, demonstrámos alto rendimento incorporação de tais aminoácidos GPCRs e ultra rápida GPCR rotulagem na superfície de células de mamífero vivo30recentemente. Rotulado de receptores foram ainda funciona, como eles fisiologicamente internalizado em cima ativando o receptor com um agonista. O protocolo experimental para a incorporação de opaco Ancora em GPCRs e etiquetando as etapas a seguir são descritas aqui. Equipar GPCRs com pequenas fluorophores brilhante é o primeiro passo fundamental para o estudo da dinâmica estrutural GPCR na célula ao vivo através de técnicas avançadas de microscopia.

Protocol

1. baseado em fluorescência triagem das eficiências de incorporação (Figura 1) Manter as células HEK293 no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM; alta glicose, glutamina 4mm, piruvato) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 100 de U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2. As células da semente no dia anterior do transfection. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/P…

Representative Results

O esboço do ensaio da fluorescência é retratado na Figura 1. O ensaio é empregado em três aplicações. Em primeiro lugar, um número de variantes de tRNA para incorporação de Lys(Boc) pelo par Pyl ortogonais é selecionado. Lys(BOC) é um aminoácido estericamente semelhante ao Pyl. Como Pyl não está comercialmente disponível, Lys(Boc) é comumente usado como um substrato padrão para o PylRS. Os tRNAs selecionados baseiam o tRNAPyl. Cad…

Discussion

O protocolo descreve um ensaio simples e confiável para avaliar a eficiência de pares ortogonais para a incorporação de ncAAs proteínas expressado em células de mamíferos. A principal vantagem deste método em relação aos ensaios amplamente utilizados, com base na FACS é que permite a preparação simultânea e medição de um maior número de amostras e fornece dados que facilmente são analisados usando um software comum. A disponibilidade de um rendimento médio método para analisar pares ortogonais em cél…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi fundado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob bolsas CO822/2-1 (programa de Emmy Noether) e CO822/3-1 ao I.C.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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