طريقة بسيطة وفعالة في فيفو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب بالحقن إينتراميوكارديال في الفئران
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في الفئران. تحت التخدير، تم تجسيدها في قلوب الماوس عبر الفضاء ربية الرابعة. وفي وقت لاحق، غدية تم حقن جينات محددة الترميز مع حقنه في عضلة القلب، تليها قياس التعبير البروتين عن طريق التصوير في فيفو والغربية لطخة تحليل.
Abstract
إلى حد كبير تحفيز التلاعب بالجينات على وجه التحديد في القلب التحقيق باثوميتشانيسمس أمراض القلب وإمكاناتها العلاجية. ويتحقق في فيفو إيصال الجينات الخاصة بالقلب عادة بالتسليم أما منهجية أو المحلية. حقن الجهازية عن طريق الوريد الذيل سهل وفعال في معالجة التعبير الجيني القلب باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف 9 (AAV9). بيد أن هذا الأسلوب يتطلب كمية عالية نسبيا من ناقلات لكفاءة توصيل، وقد ينتج عن توصيل الجهاز nontarget الجينات. وهنا يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة، وتوفير الوقت لحقن إينتراميوكارديال في فيفو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في الفئران. تحت التخدير (بدون تهوية)، تم تشريح العضلات الرئيسية والثانوية صدري صراحة، وتعرضت قلب الماوس بسرعة بتخريج اليدوي من خلال شق صغير في الفضاء ربية الرابعة. وفي وقت لاحق، تم حقن إتش ترميز لوسيفراس (لوك) ومستقبلات فيتامين (د) (لزاما)، أو دبوس الشعر القصير الحمض النووي الريبي (شرنا) استهداف لزاما، مع حقنه هاملتون في عضلة القلب. اللاحقة في فيفو تصوير أثبتت أن لوسيفراس كان أوفيريكسبريسيد بنجاح على وجه التحديد في القلب. وعلاوة على ذلك، أكد تحليل لطخة غربية overexpression ناجحة أو إسكات لزاما في قلب الماوس. متى يتقن، يمكن استخدام هذا الأسلوب للتلاعب بالجينات، فضلا عن حقن الخلايا أو مواد أخرى مثل نانوجيلس في قلب الماوس.
Introduction
أمراض القلب هي السبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم1،2. عدم وجود استراتيجيات علاجية فعالة لأمراض القلب تهدد الحياة بما في ذلك احتشاء عضلة القلب وفشل القلب يجذب استكشاف مكثفة من باثوميتشانيسمس الأساسية، وتحديد الخيارات العلاجية رواية3. لهذه الاستكشافات العلمية، هو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب المستخدمة على نطاق واسع4،5. التلاعب بالجينات القلب يمكن أن يتحقق عن طريق تحرير الجينوم باستخدام نوكلاس المستجيب مثل المنشط النسخ قوية (TALEN) وتجمع بانتظام إينتيرسباسيد يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)/كريسبر المرتبطة البروتين 9 (Cas9) الأدوات، أو عن طريق تسليم المواد الوراثية خارج الرحم (مثلاً، نواقل فيروس يحمل جينات ترميز البروتينات للفائدة)6. على الرغم من تحرير الجينوم تسمح التعديلات الجينوم الدقيقة والزمانية المكانية في الفئران الحية، إلا أنها لا تزال الناحية العملية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة6. وبدلاً من ذلك، إجراء معالجة الجينات الخاصة بالقلب بناقل الفيروس أو التدخل الصغيرة تسليم مجمع الجيش الملكي النيبالي (siRNA) يتم بصورة روتينية6.
ويتحقق تسليم ناقل الفيروس إلى قلب الماوس الكبار باستراتيجيتين تقريبا: حقن النظمية أو المحلية. حقن النظمية للنمط المصلي المسيطر كارديوتروبيك من آفس مثل AAV9 موسع ل التلاعب بالجينات محددة القلب7. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب كمية عالية نسبيا من ناقلات اللازمة لتوصيل تتسم بالكفاءة، والتعبير الجيني، وقد يؤدي مهمة توصيل أجهزة nontarget مثل العضلات و الكبد7. حقن الفيروسات المحلي يتحقق عن طريق الحقن إينتراميوكارديال أو الولادة إينتراكوروناري7. تسليم إينتراكوروناري يؤدي إلى توزيع أكثر توازناً للفيروس داخل القلب مقارنة بحقن إينتراميوكارديال. عيوب هذا الأسلوب غير الغسيل السريع خارجاً من النواقل الفيروسية إلى الدوران الجهازي وتوصيل في أجهزة nontarget8, ومتطلباتها من الأجهزة لقياس الضغط أثناء العملية. في المقابل، تمكن حقن إينتراميوكارديال أفضل الاحتفاظ بالفيروس في عضلة القلب فضلا عن تسليم موقع معين، ولكن فشل لتوزيعها بالتساوي الفيروسية ناقلات7. للحيوانات الصغيرة، يتم تسليم إينتراكوروناري صعبة من الناحية الفنية لإجراء، بينما الجهازية AAV9 حقن وحقن إينتراميوكارديال هي أكثر شيوعاً تمارس4،،من57. على الرغم من أن حقن النظامية من السهل القيام، يتطلب التهوية الميكانيكية و thoracotomy حقن إينتراميوكارديال التقليدية يسبب تلف الأنسجة واسعة النطاق، وتستغرق وقتاً طويلاً.
وفي هذا التقرير، وصفت لنا طريقة سهلة، وتوفير الوقت، وذات كفاءة عالية لحقن إينتراميوكارديال. تم حقن إتش ترميز لوسيفراس ولزاما، أو شرنا استهداف لزاما، للتلاعب بالجينات القلب. متى يتقن، يمكن استخدام هذا الأسلوب للتلاعب بالجينات، فضلا عن حقن الخلايا أو غيرها من المواد في قلب الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا التقرير يوضح تقنية معدلة لحقن إينتراميوكارديال من النواقل الفيروسية للتلاعب بالجينات القلب، الذي عدل من أسلوب لتحريض احتشاء عضلة القلب بغاو et al. 13 حاليا، في فيفو توصيف لوظائف الجينات محددة في أغلب الأحيان تنطوي على توليد خروج المغلوب أو الفئران المعدلة وراثيا<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “الصندوق الوطني للعلوم” للعلماء الشبان البارزين (81625002)، الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (81470389، 81270282، 81601238)، البرنامج من شانغهاي أكاديمية بحوث الزعيم (18XD1402400)، وبلدية شانغهاي التعليم اللجنة جوفينج الطب السريري منحة الدعم (20152209)، مركز تطوير مستشفى في شانغهاي شينكانج (16CR3034A)، جامعة شانغهاي جياو تونغ (YG2013MS42)، شانغهاي جياو تونغ جامعة مدرسة الطب (15ZH1003 و 14XJ10019)، شانغهاي الإبحار (18YF1413000)، وبرنامج الابتكار بعد التخرج من كلية الطب بنغبو (Byycx1722). ونشكر الدكتور آر قاو لمساعدته السابقة في المختبر لدينا.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
Referências
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
