Een eenvoudige en efficiënte methode voor In Vivo Cardiac-specifieke genetische manipulatie door Intramyocardial injectie in muizen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor cardiale-specifieke genetische manipulatie in muizen. Onder verdoving, werden de muis harten externalized door de Vierde intercostale ruimte. Vervolgens blot adenovirussen coderen specifieke genen werden ingespoten met een injectiespuit in het myocardium, gevolgd door eiwit expressie meting via in vivo imaging en Western analyse.
Abstract
Genetische manipulatie specifiek in het hart aanzienlijk versterken het onderzoek van hart ziekte pathomechanisms en hun therapeutisch potentieel. In vivo cardiale-specifieke gen levering wordt vaak bereikt door lokale of systemische levering. Systemische injectie via staart ader is eenvoudig en efficiënt in de cardiale genexpressie manipuleren met behulp van recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). Echter, deze methode vereist een relatief hoge hoeveelheid vector voor efficiënte signaaltransductie, en kan resulteren in nontarget orgel gene transductie. Hier beschrijven we een eenvoudige, efficiënte en tijdbesparende methode van intramyocardial injectie voor in vivo cardiale-specifieke genetische manipulatie in muizen. Onder verdoving (zonder ventilatie), de primaire en secundaire borstspieren waren ronduit ontleed, en het hart van de muis was snel blootgesteld door handmatige externalization via een kleine incisie in de Vierde intercostale ruimte. Adenovirus codering luciferase (Luc) en vitamine D-receptor (VDR), of korte haarspeld RNA (shRNA) gericht op VDR, werd vervolgens met een spuit Hamilton geïnjecteerd in het myocardium. Latere in vivo imaging aangetoond dat luciferase was succesvol overexpressie specifiek in het hart. Bovendien bevestigd westelijke vlekkenanalyse de succesvolle overexpressie of zwijgen van VDR in het hart van de muis. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt voor genetische manipulatie, evenals de injectie van cellen of andere materialen zoals nanogels in het hart van de muis.
Introduction
Cardiale ziekte is de belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd1,2. Het gebrek aan effectieve therapeutische strategieën voor levensbedreigende hartaandoeningen met inbegrip van myocardinfarct en hartfalen trekt intensieve verkenning van onderliggende pathomechanisms en identificatie van nieuwe therapeutische opties3. Voor deze wetenschappelijke verkenningen is cardiale-specifieke genetische manipulatie gebruikte4,5. Cardiale genetische manipulatie kan worden bereikt door het genoom bewerken met behulp van de krachtige transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) / CRISPR geassocieerde eiwit 9 (Cas9) hulpmiddelen, of door levering van ectopische genetische materialen (bijv., virus vectoren uitvoering genen coderend voor eiwitten van belang)6. Hoewel genoom bewerken kunt wijzigingen van de precieze en Spatio genoom in levende muizen, is het nog steeds een tijdrovend en arbeidsintensief praktijk6. Als alternatief, cardiale-specifieke genetische manipulatie door virus vector of kleine interfereren RNA (siRNA) complexe levering worden routinematig uitgevoerd6.
Virus vector levering aan het hart volwassen muis wordt bereikt door ruwweg twee strategieën: systemische of lokale injectie. Systemische injectie van cardiotropic serotype van AAVs zoals AAV9 is noninvasive voor cardiale specifiek gen manipulatie7. Echter, deze methode vereist een relatief hoge hoeveelheid vector nodig voor efficiënte transductie en genexpressie, en kan resulteren in aanzienlijke transductie van nontarget organen zoals de spieren en de lever7. Lokale virus injectie wordt bereikt door intramyocardial injectie of intracoronary levering7. Intracoronary levering leidt tot een meer gelijkmatige verdeling van het virus binnen het hart in vergelijking met intramyocardial injectie. De nadelen van deze techniek zijn echter de snelle wash out van virale vectoren aan de systemische circulatie en Signaaltransductie in nontarget organen8, en de eis van apparaten voor de meting van de druk tijdens de operatie. Intramyocardial injectie maakt betere retentie van het virus in het myocardium evenals Sitespecifiek levering, maar het mislukt gelijkmatig verdelen virale vector daarentegen,7. Voor kleine dieren is intracoronary levering technisch moeilijk uit te voeren, terwijl de systemische AAV9 injectie en intramyocardial injectie meer algemeen beoefend4,5,7 zijn. Hoewel systemische injectie gemakkelijk uit te voeren is, conventionele intramyocardial injectie vereist mechanische ventilatie en Thoracotomie, uitgebreide weefselschade veroorzaakt, en tijdrovend is.
In dit verslag beschreven we een eenvoudige, tijdbesparende en zeer efficiënte methode voor intramyocardial injectie. Adenovirus codering luciferase en VDR of shRNA targeting VDR, werd geïnjecteerd om te manipuleren cardiale genexpressie. Eenmaal onder de knie, kan deze methode worden gebruikt voor genetische manipulatie, evenals de injectie van cellen of andere materialen in het hart van de muis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het onderhavige verslag toont een gemodificeerde techniek voor intramyocardial injectie van virale vectoren voor cardiale genetische manipulatie, die werd gewijzigd van een methode voor myocardiaal infarct inductie door Gao et al. 13 momenteel, in vivo karakterisering van specifiek gen functies meestal betrekking hebben op de generatie van knock-out of transgenic muizen3,14,15,</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Science Fund voor DN jonge geleerden (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), van Shanghai academisch onderzoek programmaleider (18XD1402400), Shanghai gemeentelijke Onderwijs Commissie Gaofeng klinische geneeskunde financiële steun (20152209), Shanghai Shenkang ziekenhuis Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong Universiteit (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 en 14XJ10019), Shanghai zeilen programma (18YF1413000), en postdoctorale innovatie programma van Bengbu Medical College (Byycx1722). Wij Dr. Erhe Gao bedanken voor zijn eerdere hulp in ons lab.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
Referências
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
