تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد في أكسولوتل (ميكسيكانوم أمبيستوما)
Summary
نقدم هنا البروتوكولات تخطيط صدى القلب للحصول على الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لقلب ينبض من السمندر أكسولوتل (ميكسيكانوم أمبيستوما)، أنواع نموذجية في إنعاش القلب. تسمح هذه الأساليب لتقييم وظيفة القلب بدقة عالية الزمانية المكانية الطولية.
Abstract
قصور القلب نتيجة مرض القلب الاقفاري يشكل تحديا رئيسيا، والعلاجات التجديدي للقلب في ارتفاع الطلب. عدد قليل من أنواع نموذجية مثل الزرد والوزغ قادرة على إنعاش القلب الجوهرية تبشر بمستقبل العلاجات التجدد للمرضى البشر. لتقييم نتائج تجارب كارديوريجينيراتيفي من المحتم أنه يمكن رصد وظيفة القلب. سلمندر axolotl (A. ميكسيكانوم) تمثل أنواع نموذجية راسخة في البيولوجيا التجدد بلوغ الأحجام التي تسمح لتقييم وظيفة القلب. والغرض من هذا البروتوكول إنشاء طرق لتكاثر قياس وظيفة القلب في أكسولوتل استخدام تخطيط صدى القلب. هو أظهر تطبيق المسكنات المختلفة (البنزوكائين ومرض التصلب العصبي المتعدد-222 بروبوفول)، ويرد وصف للحصول على بيانات مشخصين (2D) ثنائي الأبعاد في أكسولوتلس تخديره وأونانيسثيتيزيد على حد سواء. تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد للقلب (3D) ثلاثي الأبعاد يمكن أن تعاني من عدم الدقة والموضوعية من القياسات، والتخفيف من حدة هذه الظاهرة طريقة متينة، إلا وهي تحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة، لقياس وتقليل هذا التحيز تظاهر. وأخيراً، يرد وصف طريقة الحصول على بيانات مشخصين 3D القلب axolotl الضرب بدقة عالية للغاية الزمانية المكانية ومع تباين الدم إلى الأنسجة وضوحاً. عموما، ينبغي توفير الوسائل اللازمة لتقييم وظيفة القلب وتشريح النموذج هذا البروتوكول، وتدفق الديناميات في أكسولوتل استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية مع التطبيقات في علم الأحياء التجدد والتجارب الفسيولوجية العامة.
Introduction
مرض القلب الاقفاري سبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1،2. على الرغم من أن العديد من البقاء على قيد الحياة من احتشاء عضلة القلب بسبب التدخل الطبي السريع وصقلها، الحوادث الدماغية في البشر غالباً ما تؤدي إلى ندبات تليفية المرتبطة بتضخم وعطل كهربائي، وتناقص قدرة وظيفية للقلب . وهذا الافتقار إلى إمكانات التجدد أنسجة القلب مشترك بين الثدييات ورغم المطالبات المثيرة للجدل لإنعاش القلب الثدييات، هذه كانت محدودة لسلالات مورين محددة3،4 و نقص يعامل الفئران5. وهكذا، ميدان البيولوجيا والطب التجديدي القلب يقتصر عموما على غير الثدييات نماذج حيوانية دراسة الظواهر التجدد قلب الجوهرية. الزرد (دانيو rerio) أنشئت في العقد الماضي نموذجا تتسم معظم جيدا للقلب الذاتية التجدد6،،من78،9،10 . سبب مختبر سهلة الصيانة، وقت جيل قصيرة ومجموعة واسعة من الأدوات الجزيئية المتاحة، الزرد تكييف كنموذج للآليات الوراثية والجزيئية التي ترتكز عليها التنمية القلب والتجدد. ومع ذلك، بالأبعاد الدقيقة لقلب الزرد جعله أقل ملاءمة للتقييم الوظيفي، والإجراءات الجراحية المعقدة ونسأله غير تيترابود من الزرد حدود المعقول استقراء النتائج التي توصل إليها في هذه الأنواع، وبالتالي تبرير استخدام نماذج tetrapod أخرى أكبر. وكان من نماذج أقرب من قلب الفقاريات التجدد من البرمائيات كودات، نيوت الشرقية (فيريديسسينس نوتوفثالموس)11، وأنواع التي ما زال نموذج قيمة12.
في السنوات الأخيرة آخر كودات البرمائية، أكسولوتل المكسيكية (A. ميكسيكانوم) قد دخلت الساحة ككبير (يصل إلى 100 جرام جسم الجماعي) والغاية مختبر قابلة للتكيف الحيوان نموذج لمجموعة واسعة من التخصصات التجدد التي تغطي التجدد أطرافهم، إصابة الحبل الشوكي، وإنعاش القلب13،،من1415،،من1617. Axolotl عالية قابلة للقياسات الوظيفية على القلب باستخدام تخطيط صدى القلب عالية التردد وغياب الهياكل متكلسة في الجانب البطني من القلب يسمح للتصوير بمستوى أقل بكثير من الصورة التحف (الصوتية بالموجات فوق الصوتية التظليل وصدى خاصة) مما لوحظ في الحيوانات النموذجية الأخرى مع متكلسة القص والاضلاع.
البروتوكول التالي توضح هذه المقالة العديد من الأساليب المختلفة والأعمال التحضيرية (الشكل 1و الشكل 2) للحصول على قياسات مشخصين استنساخه على القلب أكسولوتل في كلا تخديره (تطبيق المسكنات المختلفة الثلاثة: البنزوكائين ومرض التصلب العصبي المتعدد-222 بروبوفول) وأونانيسثيتيزيد الحيوانات في اثنين (الشكل 3، الرقم 4، الرقم 5، الرقم 6، و الرقم 7، و ملفات تكميلية 1-12)، وثلاثة (الرقم 8، الرقم 9، ملفات تكميلية 13-14) الأبعاد المكانية. قلب البرمائيات ثلاث غرف (اتريا اثنين ومن طين واحدة). الاذينين هي توفرها وريدية الجيوب الأنفية كبيرة، ويصب البطين في المسالك تدفق السالكة كونوس (الشكل 2). حيث ينصب معظم التركيز تقليديا على التجدد البطين وبدرجة أقل على الانتعاش من الاذينين6،7،،من89،،من1011 , 12 , 14 , 17، هذا البروتوكول يركز أساسا على قياسات لوظيفة البطين.
تخطيط صدى القلب البرمائية ليس وصف جيدا في الأدب، وتطوير الأساليب 2D المذكورة في هذه الورقة يكون مدفوعا بالحاجة إلى تمثيل أفضل وظيفة القلب axolotl الضرب في وقت معين والإعداد التجريبية. وهكذا، الأساليب الموصوفة هنا المطبقة في التجارب التجديدية القلب حيث يمكن مراقبة وظيفة القلب مرارا وتكرارا على مدى عملية التجديد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الأساليب المطبقة في التجارب كارديوفيسيولوجيكال في أكسولوتل بصورة عامة أو تعديل طفيف تمتد إلى نماذج البرمائية كودات أو أنوران أخرى (e.g.,Xenopus). أكسولوتل موجود في العديد من سلالات مختلفة وتباين الألوان (مثلاً، wildtype، ميلانويد، أبيض، ألبينو، الأبيض المحورة وراثيا مع تعبير البروتينات الفلورية الخضراء)، ولكن هذه الخصائص لا تؤثر على التوافق أكسولوتل مع بروتوكول وصف. الأسلوب الموصوفة هنا الحصول على بيانات مشخصين 3D نسخة معدلة من تقنية الارتباط (الإدامة) صورة الزمانية المكانية المتقدمة بالموجات فوق الصوتية السريرية والدرجة الثانية متوسط الطريقة الموصوفة سابقا في الدجاج النامي إلى تعزيز الإشارة الواردة من تلامس الدم في الأنسجة الرخوة في الأنواع التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء المنواه18،19. هذا الأسلوب يسمح للنمذجة المتقدمة انقباض القلب وديناميات السوائل محسوب في قلب أكسولوتل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تخطيط صدى القلب أكسولوتل وغيرها من الأنواع غير الثدييات غلة البيانات تختلف اختلافاً جوهريا من الثدييات ضربات القلب بسبب طبيعة الأنوية من خلايا الدم الحمراء في جميع الفقاريات عدا الثدييات الكبار. هذه النتائج في إشارة دم وضوحاً وأقل على النقيض من الدم إلى الأنسجة في الصور مشخصين axolotl مقارن…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف كاسبر هانسن، معهد العلوم البيولوجية، جامعة آرهوس لتوفير إمكانية الوصول إلى والمساعدة مع ميكرومانيبولاتور الإلكترونية لاكتساب مشخصين 3D.
Materials
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
Referências
- Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
- Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
- Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
- Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
- Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
- McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
- Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
- Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
- Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , (2017).
- Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).
