2D- og 3D-Echocardiography i Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Summary

Her presenterer vi echocardiography protokoller for todimensjonal og tredimensjonale image vinningen av det bankende hjertet av axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), en modell Art i hjertet gjenfødelse. Disse metodene tillater langsgående evaluering av hjertefunksjon høy spatiotemporal oppløsning.

Abstract

CARDIAC funksjonsfeil som følge av iskemisk hjertesykdom er en stor utfordring, og regenerativ Therapy til hjertet er i høy etterspørsel. Noen modell arter som sebrafisk og Salamandere som kan iboende hjertet gjenfødelse avholde Love for fremtidige regenerativ Therapy for menneskelige pasienter. Å vurdere utfallet av cardioregenerative eksperimenter er det viktig at hjertefunksjon kan overvåkes. Axolotl salamander (A. mexicanum) representerer en veletablert modell Art i regenerativ biologi oppnå størrelser som tillater evaluering av hjertefunksjon. Formålet med denne protokollen er å etablere metoder for å måle reproduserbar hjertefunksjon i axolotl med echocardiography. Bruk av ulike bedøvelse (benzocaine, MS-222 og propofol) er vist, og oppkjøpet av todimensjonal (2D) echocardiographic data i både bedøvet og unanesthetized axolotls er beskrevet. 2D echocardiography av tredimensjonale (3D) hjertet kan lide av upresisjonsverdier og subjektivitet av målinger, og å lindre dette fenomenet en heldekkende metode, nemlig intra/inter-operator/observatør analyse, å måle og minimere denne skjevhet er vist. Til slutt, en metode for å få 3D echocardiographic data av det bankende axolotl hjertet med en svært høy spatiotemporal oppløsning og med uttales blod til vev kontrast er beskrevet. Samlet bør denne protokollen gi nødvendig metodene for å evaluere hjertefunksjon og modell anatomi, og flyte dynamikk i axolotl med ultralyd imaging programmer både regenererende biologi og generell fysiologiske eksperimenter.

Introduction

Iskemisk hjertesykdom er en ledende årsak til død verdensomspennende^1,2. Selv om mange overleve et hjerteinfarkt på grunn av rask og finjustert medisinsk intervensjon, føre iskemiske hendelser i mennesker ofte til fibrotiske arrdannelse tilknyttet hypertrofi, elektriske feil og en redusert fysisk kapasitet av hjertet . Denne mangelen på regenerativ potensialet i cardiac vev er delt blant pattedyr og selv kontroversielle påstander om pattedyr cardiac gjenfødelse er rapportert, disse er begrenset til spesifikke murine stammer^3,4 og hypoksi behandlet mus⁵. Dermed er cardiac regenerativ medisin og biologi vanligvis begrenset til ikke-pattedyr dyremodeller å studere iboende hjertet regenerativ fenomener. Sebrafisk (Danio rerio) har i det siste tiåret etablert seg som den mest godt preget modellen for indre hjertet gjenfødelse^6,7,8,9,10 . Enkelt laboratorium vedlikehold, en kort generasjonstid og et bredt utvalg av molekylære verktøy er sebrafisk godt tilrettelagt som en modell for genetiske og molekylære mekanismer underliggende hjerte utvikling og regeneration. Imidlertid minutt dimensjonene av sebrafisk hjertet gjør det mindre egnet for funksjonell evaluering, og komplisert kirurgiske prosedyrer og ikke-landlevende virveldyr phylogeny av sebrafisk begrenser den fornuftige ekstrapolering av funnene i denne arten, dermed rettferdiggjøre bruk av andre større tetrapod modeller. En av de tidligste modellene av virveldyr hjertet gjenfødelse var en caudate amfibier, den østlige newt (Notophthalmus viridescens)¹¹, en art som forblir en verdifull model¹².

De siste årene har en annen caudate amfibier, den meksikanske axolotl (A. mexicanum) entret scenen som en stor (opp til 100 g kroppen masse) og svært laboratorium tilpasningsdyktig dyr modell for en rekke regenerativ fagområder som spenner over lem gjenfødelse, ryggmargsskade og kardiale gjenfødelse^{13,14,15,16,17}. Axolotl er svært mottakelig for funksjonell målene på hjertet bruker høyfrekvente echocardiography og fravær av calcified strukturer på ventral side av hjertet gir mulighet for ultralyd imaging med et mye lavere bilderester (akustisk skygge og gjenklang spesielt) enn observert i andre modellen dyr med calcified sternum og hinner.

Følgende protokollen beskriver flere ulike metoder og forberedelsene (figur 1, figur 2) å erverve reproduserbar echocardiographic mål på axolotl hjertet i både anesthetized (bruke tre forskjellige bedøvelse: benzocaine, MS-222 og propofol) og unanesthetized dyr i to (Figur 3 4 figur figur 5, figur 6, figur 7, Utfyllende filer 1-12) og tre (Figur 8, finne 9, Supplerende filer 13-14) romlige dimensjoner. Amfibier hjertet er tre-chambered (to atria og en enkelt ventrikkel). Atria leveres av en stor sinus venosus og ventrikkel munner ut i den conus arteriosus utløp skrift (figur 2). Siden Hovedvekten er tradisjonelt monterte på ventrikkel regenerasjon og mindre på utvinning atria^{6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17}, denne protokollen hovedsakelig fokuserer på målinger av ventrikkel funksjon.

Amfibier echocardiography er ikke godt beskrevet i litteraturen, og utviklingen av 2D metodene som er beskrevet i denne artikkelen har vært drevet av behovet for å best representerer funksjonaliteten til slo axolotl hjertet på et gitt tidspunkt og eksperimentelle innstillingen. Dermed er metodene som er beskrevet her gjeldende i hjertet regenerativ eksperimenter der hjertefunksjon kan overvåkes gjentatte ganger i løpet av en gjenoppbyggingsprosessen. Metodene kan i tillegg brukes cardiophysiological eksperimenter på axolotl generelt eller endret litt slik at den dekker andre caudate eller springpadder amfibier modeller (e.g.,Xenopus). Axolotl finnes i flere forskjellige stammer og fargevariasjoner (f.ekswildtype melanoid, hvit, albino, transgene hvit med grønne fluorescens protein uttrykk), men disse egenskaper påvirker ikke kompatibiliteten til den Axolotl med beskrevet protokollen. Metoden beskrevet her for å erverve 3D echocardiographic-data er en modifisert versjon av den spatiotemporal sammenheng (STIC) teknikken utviklet for klinisk ultralyd og kvadratiske gjennomsnitt metoden beskrevet tidligere i utviklingsland kylling til forbedre signalet fra blod flekker i bløtvev i arter som inneholder kjerne røde blodlegemer^18,19. Denne metoden gir avansert modellering av cardiac sammentrekning og beregnede fluid dynamikk i axolotl hjertet.

Protocol

Fremgangsmåtene i denne protokollen var i samsvar med den danske nasjonal for omsorg og bruk av forsøksdyr og eksperimentene ble godkjent av danske nasjonale dyr eksperimenter Inspectorate (protokollen # 2015-15-0201-00615). 1. forberedelser Forberede axolotl medium. Bruk høy kvalitet ikke kjemisk behandlet vann fra springen som axolotl medium. Hvis dette er tilgjengelig, bruker du 40% Holtfreter løsning. Forberede 40% (wt/vol) Holtfreter løsning ved å løse …

Representative Results

Intrapericardial plass i axolotl er avhengig av størrelsen på dyret. Mindre dyr (2-20 g, 7-15 cm) vil ha et overskudd av perikard væske (vises mørk i echocardiography) rundt cardiac chambers mens i større seksuell modne dyr (> 20 g, > 15 cm) chambers vil oppta de fleste av de intrapericardial plass. For å gi den beste oversikten for representant resultatene av echocardiographic utsikt over axolotl hjertet, ble en mindre dyr (10 g, 10 cm) brukt for Figur 3</stron…

Discussion

Echocardiography i axolotl og andre ikke-pattedyr arter gir annen data enn pattedyr echocardiography hen kjerne av røde blodlegemer i Alle virveldyr unntatt voksen pattedyr. Dette resulterer i et uttalt blod signal og mindre blod til vev kontrast i axolotl echocardiographic bilder sammenlignet eksempelvis musen eller menneskelig echocardiography. Dette kan gjøre bildesegmentering på ubehandlet enkeltbilde ultralyd bildene mer vanskelig som det kan være vanskelig å skille blod fra vev. Dette fenomenet kan im…

Materials

Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator	Zeiss	NA
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
MS-222	Sigma-Aldrich	886-86-2	ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol	B. Braun Medical A/S	NA	2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NaCl
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8	CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	10034-99-8	MgSO4·7H2O
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	KCl
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block	N/A	N/A	Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap	N/A	N/A	Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape	BSN Medical	72359-02	Leukoplast sleek
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Kimwipes, disposable wipers
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.