Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van de samenstelling van de eiwitten van groot eiwit: eiwit en eiwit: nucleïnezuur complexen van koolzaad (B. napus) floëem afgescheiden met behulp van een 3D polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) aanpak combineren blauw native (BN) met twee denatureren pagina’s, gevolgd door massaspectrometrische identificatie.
Bemonstering van het floëem van hogere planten is vaak moeizaam en sterk afhankelijk van de plantensoorten. Proteoom studies onder voorwaarden denaturering kunnen echter gebeuren in verschillende plantensoorten. Eiwit: eiwit en eiwit: nucleïnezuur complexen van floëem monsters hebben nog nauwelijks is geanalyseerd, hoewel ze een belangrijke rol in het onderhoud van deze gespecialiseerde compartiment of interlokale signalering spelen misschien. Grote moleculaire verzamelingen kunnen worden afgezonderd met behulp van een blauwe inheemse gelelektroforese (BN-pagina). De eiwit-onderdelen kunnen worden gescheiden door een latere natrium dodecyl sulfaat (SDS-pagina). Echter, proteïnen met gelijkaardige molecuulgewichten mede migreren, wat eiwit identificatie door massaspectrometrie kan belemmeren. BN-pagina combineren met twee verschillende denatureren gel elektroforese stappen, namelijk Tris-Tricine-ureum en SDS-pagina, kunt de extra scheiding van proteïnen volgens hun hydrophilicity/hydrophobicity en dus verhoogt de resolutie en het succes eiwit identificatie. Het laat zelfs eiwitten die alleen in hun posttranslationele modificaties verschillen onderscheid te maken. Blauwe inheemse noordelijke bevlekken kan bovendien worden toegepast ter identificatie van de componenten van de RNA in macromoleculaire complexen. We laten zien dat ons protocol geschikt is voor het ontrafelen van de eiwitten en RNA onderdelen van eiwit: eiwit en ribonucleoprotein (RNP) complexen die zich voordoen in het floëem monsters. Het combineren van een blauwe inheemse pagina met twee verschillende denatureren pagina stappen kan helpen om te scheiden van de verschillende soorten grote eiwitcomplexen, en kunt ook een grotere identificatie tarief van hun componenten door massaspectrometrie. Bovendien is het protocol is robuust genoeg om te detecteren gelijktijdig potentieel afhankelijke nucleïnezuren binnen één eiwitcomplexen.
De lange leidingen van het floëem zijn essentieel voor de toewijzing van organische nutriënten in hogere planten, maar zijn ook betrokken bij de regulering van vele verschillende processen belangrijk voor groei en ontwikkeling, pathogen defensie, en de aanpassing aan de nadelige milieu-omstandigheden. Naast kleine effectoren zoals ionen, fytohormonen of metabolieten zelf, macromoleculen zoals eiwitten en RNAs hebben onlangs naar voren gekomen als mogelijke signalen.
Studies hebben aangetoond dat floëem laden van eiwitten is grootte afhankelijk en gecontroleerd door de uitsluiting limiet (SEL) van de porie-plasmodesmal eenheden aansluiten metgezel cellen (CC) en elementen (SE), die meestal in het bereik van 10 te zeef > 67 kDa1 , 2 , 3. echter, ondanks deze grootte beperkingen grotere proteïnen en eiwit binnen het floëem systeem het idee van grootte uitsluiting4uitdagende complexen zijn bevonden, en zelfs niet-specifieke verlies van eiwitten uit CC aan SE geweest voorgestelde5 .
Zowel de multiprotein als de grote ribonucleoprotein complexen spelen cruciale rol in de biosynthese en handhaven van de structurele integriteit van de cel-6. Er is bewijs dat floëem-mobiele eiwit-eiwit en ribonucleoprotein complexen bestaan4,7, maar tot nu toe weinig over hun functie is bekend. In het floëem zeef elementen zijn eiwit: eiwit en RNP complexen betrokken met het vervoer over lange afstanden en / of signalering8,9. Is vereist om te ontrafelen van de functies van de translocated complexen, het bestuderen van hun samenstelling onder variërende milieu of stress voorwaarden. Om dit te bereiken, inheemse complexen hebben worden geïsoleerd en hun componenten moeten worden gescheiden met voldoende resolutie.
Hoog-moleculair-gewicht complexen uit het floëem te isoleren, is het eerst nodig om te sap monsters in voldoende kwaliteit en kwantiteit krijgen. De techniek die worden voor floëem bemonstering gebruikt kan, hangt af van de plantensoorten van belang. Drie belangrijkste methoden om te verkrijgen floëem sap bestaan 10: insect stylectomy11, EDTA-vergemakkelijkt afscheiding12en spontane afscheiding13.
Floëem monsters van Arabidopsis thaliana (A. thaliana), de grote model-fabriek in laboratoria wereldwijd, kunnen alleen worden verkregen door EDTA-vergemakkelijkt afscheiding of bladluis stylectomy14,15. Beide methoden leiden tot sterk verdunde floëem sap of zeer lage monster bedragen. EDTA-vergemakkelijkt afscheiding is ook gevoelig voor besmetting en misschien niet de echte floëem samenstelling16vertegenwoordigen. Spontane floëem afscheiding is beperkt tot plantensoorten zoals Cucurbitaceae met niet, lupine of yucca, waar afsnijden van plantendelen leidt tot een spontane emissie van floëem sap die kan gemakkelijk verzamelde13,17,18, 19. We onlangs koolzaad (Brassica napus) opgericht als een geschikt modelsysteem floëem p.a., omdat het een nauwe verwant van A. thaliana en verschillende microliters van floëem sap kan worden verkregen bij kleine incisies dat is aangetoond dat worden van hoge zuiverheid4,8,20. Bovendien, het genoom B. napus werd uitgebracht in 201421.
Met uitzondering van de bladluis stylectomy, alle floëem collectie beschreven methoden omvatten beschadigen van het omliggende weefsel op de plaats van bemonstering, en de samenstelling van floëem sap kan veranderen in reactie op schade. Daarom is het essentieel om de kwaliteit van floëem monsters, ongeacht de toegepaste methode van monsterneming te controleren. Er zijn verschillende methoden voor kwaliteitscontrole van de verzamelde floëem sap, bijvoorbeeld door het bepalen van RNase activiteit22,23, RT-PCR met inleidingen tegen Rubisco8,24, of de analyse van de suiker samenstelling8.
Verschillende methoden te isoleren en te scheiden van eiwitcomplexen kunnen worden toegepast, met inbegrip van grootte uitsluiting chromatografie, sacharose dichtheid ultracentrifugatie of monster filtratie door membranen met verschillende moleculair gewicht snijden offs. Deze benaderingen laat echter geen hoge resolutie. De techniek genaamd blue native-pagina (BN-pagina), voor het eerst beschreven door Schägger et al. 25, is beter in termen van resolutie. Het werd met succes gebruikt om te bepalen van het molecuulgewicht van grote native eiwitcomplexen uit verschillende organellen of uit cellulaire lysates en hun relatieve abundanties26,27.
Als u wilt verder toelichten de complexe samenstelling van eiwitcomplexen, is het noodzakelijk om te scheiden van de individuele componenten onder de voorwaarden, wat leidt tot volledige demontage van de complexe onderdelen denaturering. Dit kan worden bereikt door een tweede dimensie van SDS-pagina 28,29 , of, om een hogere resolutie, door een tweede dimensie van elektrisch scherpstellen (IEF) gevolgd door een third dimension van SDS-pagina30 en latere identificatie van de eiwitten met behulp van spectrometrie van de massa.
In dit protocol beschrijven we bemonstering van pure floëem sap uit B. napus planten en de analyse van eiwitcomplexen van dergelijke floëem monsters met behulp van een 3D elektroforetische aanpak BN-pagina combineren met Tris-Tricine-ureum-pagina en SDS-pagina. De complexe onderdelen van gescheiden eiwit worden vervolgens geïdentificeerd met behulp van spectrometrie van de massa. Daarnaast introduceren we blauwe inheemse noordelijke bevlekken als een methode waardoor de detectie van RNAs in grote RNP complexen4, verlenging van de toepasbaarheid van de benadering.
Het floëem is een compartiment van groot belang, aangezien het vormt de grote transportroute voor photoassimilates, en ook essentieel is voor de lange afstand signalen tussen verschillende plantaardige delen9,20,34, 35. Naast kleine molecules, zijn macromoleculen zoals eiwitten en RNAs betrokken met floëem onderhoud en signalering4,7,8. De analyse van floëem samenstelling wordt beperkt door de beperkte toegankelijkheid tot floëem monsters in de meeste plantensoorten. Het insect stilet-techniek is breed toepasbaar, maar experimenteel veeleisende en resulteert in zeer kleine hoeveelheden floëem monsters11. Een eenvoudige techniek die gebruikt wordt voor floëem bemonstering is EDTA-vergemakkelijkt afscheiding12. EDTA chelateert divalente ionen zoals Calcium en dus voorkomt sluiting van sieve platen door P-eiwitten en callose. Het is makkelijk te gebruiken, maar is gevoelig voor besmetting door beschadigde cellen en monsters worden verdund. Afbreken divalente ionen door EDTA kan ook leiden tot een verdeling van bestaande complexen. Het maakt echter bemonstering uit een breed scala van soorten, met inbegrip van de model plant A. thaliana15. Spontane afscheiding van floëem sap treedt alleen op in een klein aantal plantensoorten. Het is een invasieve methode waarbij ernstig letsel van plantaardige weefsels10. We onlangs B. napus opgericht als een soort model voor het bestuderen van vervoer over lange afstanden4,8,20. Hier, kunt floëem sap bemonsteren van kleine incisies, waardoor verwonding effecten en bronnen van verontreiniging.
Met behulp van verschillende bemonsteringstechnieken, het proteoom van floëem monsters van verschillende plantensoorten is onderzocht in de afgelopen jaren7,8,17,36,,37, 38,39. Voor deze Proteoom studies, eiwitten werden uitgepakt en neergeslagen onder denaturerende omstandigheden en daarom laat geen conclusies over eiwit: eiwit en eiwit: nucleïnezuur interacties presenteren onder inheemse voorwaarden. Co-immunoprecipitation (CoIP) en overlay vitrotests aangegeven dat een grote ribonucleoprotein complex zou kunnen bestaan in het floëem sap pompoen €40, maar het bleek niet dat elke macromoleculaire complexen bestaan inheemse omstandigheden binnen de floëem systeem.
Blue-inheemse pagina, geïntroduceerd door Schägger et al. 26, in combinatie met latere high-resolution gel elektroforese stappen kunnen de scheiding van de afzonderlijke componenten van grote eiwitcomplexen. Met behulp van 3D-pagina analyses van inheemse B. napus floëem afgescheiden, we konden onlangs laten zien dat verschillende hoog-moleculair-gewicht eiwit: eiwit en RNP complexen bestaan in het floëem monsters en enzymatisch actieve4. Alternatieve methoden voor het isoleren van eiwitcomplexen, alsmede RNPs zoals grootte uitsluiting chromatografie kunnen bestaan, maar niet in termen van resolutie in vergelijking met BN-pagina. Bovendien, voor een redelijke kwaliteit van complexe scheiding, grootte uitsluiting kolom matrices moeten worden aangepast volgens het algemeen complexe molecuulgewicht onderzocht. Analyse van complexen van verschillende grootte zal daarom eisen voor verschillende typen kolommen die zijn kosten verbonden aan intensieve en laat niet toe als hoog scherpstellen vermogen als een BN-pagina.
Kritische stappen voor het analyseren van complexen van B. napus omvatten het totale bedrag van floëem sap gebruikt als grondstof. Ten minste 600 µL van floëem monster nodig zijn en kunnen worden verkregen uit vijf goed gedrenkt planten. Voor 3D-pagina en het noordelijke bevlekken BN is het nodig om te beginnen met de eerste BN gel met een voldoende hoeveelheid floëem monsters. Om dit te bereiken, zijn floëem monsters geconcentreerd tot 20 tot 30 µg eiwit kan worden geladen in elk goed en ten minste triplicates van hetzelfde monster parallel worden uitgevoerd. Te laag of te hoog concentraties verminderen de detectie van complexen (Figuur 3). Floëem monsters moeten worden verzameld in reactie buizen op ijs en moeten worden opgeslagen bevroren voor later gebruik om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit en omzet. Proteaseinhibitors gevonden in alle floëem proteomes geanalyseerd, maar ook een volledig actieve proteasoom werd beschreven in het floëem van B. napus4. Bovendien, volume en samenstelling van floëem monsters hangen af van de tijd-meetpunt en milieuomstandigheden10. Daarom moet worden gezorgd om te verzamelen op hetzelfde moment van de dag onder vergelijkbare omstandigheden. Stress behandelingen (bijv . droogte) kunnen verminderen de hoeveelheid floëem die kan worden verzameld. Om te identificeren één eiwitten door massaspectrometrie, is het verplicht te beperken mogelijke keratine verontreinigingen door dragen handschoenen de allertijden. Keratine leidt tot extra signalen tijdens de massa spec analyse en belemmert eiwit identificatie. De BN-pagina uitgevoerd bij een hogere spanning of bij kamertemperatuur kan leiden tot verwarming van de gel die zouden kunnen in demontage van fragiele complexen voortvloeien.
Het hier gepresenteerde protocol is geschikt voor de analyse van eiwit: eiwitcomplexen. Ook laten we zien dat het kan worden gebruikt om op te sporen specifieke RNAs vervat in de complexen in parallel. Om dit te bereiken, hebben we onlangs een protocol geïntroduceerd voor BN noordelijke bevlekken4. RNAs zijn vatbaar voor aantasting door RNAse verontreinigingen. Als u wilt beperken deze afbraak DEPC-behandeld, water moet worden gebruikt.
Belangrijkste beperkingen van de onderhavige methode omvat de schatting van het molecuulgewicht van eiwitcomplexen gescheiden door BN-pagina, omdat migratie gedrag hangt af van grootte, vorm en zelfs posttranslationele modificaties van de complexen31, 41. Schatting van de grootte van RNP complexen is nog complexer als gevolg van de invloed van nucleic zuren op het gedrag van de migratie. Het kan ook niet worden verhinderd dat complexen van dezelfde grootte samen in één enkele band migreren. Dit kan leiden tot de foutieve voorspelling van complexe composities. Daarom controleren de waargenomen interacties met aanvullende technieken, bijvoorbeeld door functionele assays4, kan het nodig zijn. Ook eiwitten slechts zwak of Transient gekoppeld aan een macromoleculaire complex zou verloren gaan in de buffer van de BN gebruikt. Om dit te vermijden, kunnen monsters kruisverwijzende, wat ook kan leiden tot artefacten of eiwit identificatie, kan voorkomen of de voorwaarden van de buffer kunnen worden geoptimaliseerd.
In tegenstelling tot de klassieke 2D-pagina, de combinatie van ureum-SDS-pagina en laat de scheiding volgens hydrophobicity en moleculair gewicht in plaats van elektrisch punt (pI) en moleculair gewicht 28, en wordt niet beperkt in de scheiding aan eiwitten van een specifieke pI bereik. Vergelijkbaar met klassieke 2D-pagina, gescheiden eiwitten zijn zichtbaar als enkele plekken, maar op een diagonale lijn 4,28 (Figuur 5, , Figuur 6). Meer hydrofobe eiwitten verschijnen in vlekken boven deze diagonaal, overwegende dat meer hydrofiele eiwitten worden gevonden onder de lijn28. De in dit protocol gebruikte polyacrylamide-concentraties worden eiwitten tussen 25 tot 80 kDa goed gescheiden. Toestaan van een scheiding van kleinere of grotere eiwitten de polyacrylamide concentratie kan worden gevarieerd of kleurovergang gels kunnen worden gebruikt in de derde dimensie. De onderdelen van complexe IV (Figuur 3) gescheiden door 3D-pagina (Figuur 6) werden uitgesneden, trypsine verteerd, en geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit resulteerde in de identificatie van verschillende tRNA ligases. De componenten van de andere complexen zijn onlangs gepubliceerd van 4. Onze 3D-pagina ingeschakeld de scheiding van verschillende ligases, namelijk aspartaat, asparagine, threonine, lysine en glycine ligases, met gelijkaardige molecuulgewichten (tabel 3). Met behulp van een methionine tRNA-specifieke sonde, we waren kundig voor speurder potentieel afhankelijke tRNA binnen complexe IV, maar als full-length tRNA of tRNA fragmenten in het complex niet kan worden onderscheiden met de sondes gebruikt. Als u wilt controleren als de nucleïnezuren echt gebonden binnen het complex en niet mede migreren, protease verteerd floëem sap kunnen monsters dienen als geschikt migratie besturingselementen.
Eerder werd gespeculeerd dat eiwit vertaling binnen floëem zeef buizen, optreden kan aangezien bijna de meeste onderdelen van de gehele ribosoom evenals rek factoren in floëem monsters4,7 gevonden. Onze bevinding van tRNA en tRNA ligases lijkt om dit idee te steunen. Echter tRNA fragmenten aanwezig in het floëem monsters van pompoen is gebleken te zijn krachtige remmers van vertaling42 en functionele ribosomen lijken afwezig zijn4, wat suggereert dat de vertaling kan niet plaatsvinden.
Samen genomen, kan het protocol hier gepresenteerd de scheiding van eiwit: eiwit en zelfs RNP complexen van floëem monsters en de scheiding en identificatie van hun individuele componenten met hoge resolutie. De toepassing van deze methode maakt de ontdekking van nieuwe eiwitten en RNP complexen in floëem monsters en daarom nieuwe functies in deze gespecialiseerde plant compartiment kan toelichten.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Jennifer Deke en Urszula Zarzenska voor hun wetenschappelijke ondersteuning. Dit werk werd financieel ondersteund door een carrière integratie subsidie (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) door de Europese Commissie binnen het 7de kader-programma, de subsidie LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburg), en de DFG grant (DFG KE 856_6-1) toegekend aan JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |