Vi beskriver anvendelse af fuldfelts optisk kohærensmikroskopi som en metode til vurdering af høj kvalitet af hornhindedonorstroma. Denne protokol kan bruges til at identificere træk, der tyder på sundhed eller sygdom, og har til formål at forbedre screening og udvælgelse af donorvæv og dermed resultaterne af keratoplastik.
Kvaliteten af donorhornhindestroma, som udgør ca. 90 % af den samlede hornhindetykkelse, er sandsynligvis en af de vigtigste, hvis ikke den vigtigste, begrænsende faktor (er) for succes med dyb anterior lamellær og gennemtrængende keratoplastik. Disse er kirurgiske procedurer, der involverer udskiftning af henholdsvis en del af eller alle de syge hornhindelaget med doneret væv, transplantatet, taget fra en nyligt afdød person. Midlerne til at evaluere stromalkvaliteten af hornhindetransplantater i øjenbanker er imidlertid begrænsede og mangler evnen til kvantitativ vurdering af sygdomsindikatorer i høj opløsning. Full-field optical coherence microscopy (FF-OCM), der muliggør 3D-billeddannelse i høj opløsning af friske eller faste ex vivo biologiske vævsprøver, er en ikke-invasiv teknik, der er velegnet til vurdering af donorhornhinden. Her beskriver vi en metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af hornhindestroma ved anvendelse af FF-OCM. Protokollen er med succes blevet anvendt på normale donorhornhinder og patologiske hornhindeknapper og kan bruges til at identificere sunde og patologiske træk på både makroskopisk og mikroskopisk niveau og derved lette påvisning af stromale lidelser, der kan kompromittere resultatet af keratoplastik. Ved at forbedre graftkvalitetskontrol har denne protokol potentialet til at resultere i bedre udvælgelse (og afvisning) af donorvæv og dermed nedsat transplantatfejl.
Hornhindesygdomme er blandt de vigtigste årsager til blindhed på verdensplan1. Nogle sygdomme kan kun behandles kirurgisk, ofte involverer udskiftning af en del (dvs. lamellær keratoplastik) eller hele (dvs. penetrerende keratoplastik) syge hornhinde, ved doneret væv, transplantatet, taget fra en nyligt afdød person. For hornhindesygdomme, der ikke påvirker endotelet (f.eks. Keratoconus, stromale ar efter infektiøs keratitis, traumer og stromale dystrofier), betragtes dyb anterior lamellær keratoplastik (DALK) i øjeblikket som den valgte kirurgiske teknik 2,3,4,5. Denne teknik muliggør bevarelsen af modtagerens hornhindeendotel ved kun at erstatte det centrale hornhindepitel og stroma, som er forbundet med en lavere forekomst af transplantatafstødning, fravær af endotelafstødning, lavere endotelcelletab og gunstigt omkostningseffektivitetsforhold 6,7,8,9,10,11 . DALK tillader endvidere, at hornhinder med mindre end optimal endotelkvalitet anvendes som transplantater, da dette kompromitterede lag ikke vil blive transplanteret12. Omvendt vil kvaliteten af donorhornhindestroma sandsynligvis være den største begrænsende faktor for transplantatsucces og synsgendannelse, fordi stroma er det eneste donorhornhindelaget, der er tilbage, mens donorepitelet erstattes af modtagerepitel. Desværre er midlerne til at vurdere donorhornhindestroma i øjenbanker begrænsede. De omfatter normalt spaltelampeundersøgelse af donorøjeæblet, når vævsudtagning foretages ved enukleation og lysmikroskopundersøgelse af donorstroma13. Nogle øjenbanker er begyndt at supplere sådanne standardprocedurer ved hjælp af Fourier-domæne optisk kohærenstomografi (FD-OCT)14.
Oftalmisk optisk kohærenstomografi (OCT), en optisk analog til ultralydsbilleddannelse15, bruger interferens fra bredbånd eller justerbart lys til at generere optiske sektioner af nethinden 16 og det forreste segment17. I tidsdomæne OCT, grundlaget for tidlige kliniske systemer, ændres placeringen af et referencespejl, således at interferensmønstre dukker op, når referencestrålen har rejst næsten samme tid som strålen reflekteret ved de forskellige vævsgrænseflader, hvor A-scanninger genereres som en funktion af tiden. I FD-OCT (også kaldet spektral- eller frekvensdomæne-OCT), grundlaget for de fleste moderne kliniske systemer, er referencespejlet fastgjort i en position, og en individuel A-scanning, med alle interferensmønstre blandet sammen, erhverves ad gangen og dissekeres fra hinanden via Fourier-analyse.
Mens kliniske (tids- eller spektraldomæne) OCT-systemer tillader tværsnitsbilleder af hornhinden og påvisning af stromale opaciteter ved en højere aksial opløsning end spaltelampebiomikroskopi, er deres laterale opløsning begrænset. Konfokal mikroskopi18 tillader undersøgelse af hornhinden ved en lateral opløsning, der nærmer sig histologisk detalje, men er begrænset aksialt.
Tomografisk mikroskopi med fuld felt af optisk kohærens (FF-OCT eller FF-OCM)19,20 kombinerer elementer fra både konfokalmikroskopi og OLT og opnår en lateral opløsning, der kan sammenlignes med den aksiale opløsning på ca. 1 μm. Mere specifikt bruger FF-OCM usammenhængende bredbåndslyskilder (f.eks. En halogenlampe) og optik med høj numerisk blænde til at erhverve 2D-tomografiske billeder uden lateral scanning. Ved at scanne i dybderetningen muliggør FF-OCM ikke-invasiv 3D-billeddannelse af friske eller faste ex vivo biologiske vævsprøver. Det er blevet brugt til at afbilde hornhinden21,22,23. Ved at give både høj opløsning en face og tværsnitsvisninger giver FF-OCM information om både hornhindens histologiske struktur og cellulære detaljer. Faktisk har FF-OCM vist sig at give strukturel information, der er bedre end histologi, og var i stand til at identificere flere sygdomsindikatorer, som det var muligt med kombinationen af spektraldomæne OCT og konfokal mikroskopi24,25.
Her beskriver vi en protokol for kvalitativ og kvantitativ vurdering af hornhindedonorstroma ved anvendelse af FF-OCM. Metoden er baseret på histologilignende analyse af makroskopiske og mikroskopiske træk, der indikerer stromal tilstand, herunder tre kvantitative stromale parametre (dvs. Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet og stromal reflektionsevne). Den beskrevne protokol anvendes derfor på normale og abnorme hornhindevæv og tillader differentiering af syge fra normalt humant hornhindevæv.
Protokollen beskrevet her til kvalitativ og kvantitativ vurdering af hornhindedonorstroma ved anvendelse af FF-OCM er baseret på histologilignende analyse af makroskopiske og mikroskopiske træk, der indikerer stromal tilstand, ud over kapaciteten af spektraldomæne OCT og konfokalmikroskopi21,24,25, og muliggør differentiering af syge fra normale humane væv.
Bortset fra en fremragende endotelkvalitetsvurdering af humane donorhornhinder ved hjælp af spejlmikroskopi, er vurdering af stromal kvalitet udfordrende i øjenbanker og generelt begrænset til en grov observation med spaltelampebiomikroskopi og / eller lysmikroskopi i nuværende protokoller. Mangel på fin opløsning med eksisterende metoder betyder ikke kun, at hornhinder med en vis stromal sygdom kan vælges, der kompromitterer resultatet af keratoplastik, men også at hornhinder kan afvises for stromale opaciteter, der faktisk er begrænsende for forreste stroma- eller epitelregioner og stadig kan bruges til endotelkeratoplastikprocedurer14.
Den nuværende øjenbankprotokol kunne suppleres med tilføjelsen af FF-OCM, som på grund af sin overlegne opløsning udgør et kraftfuldt og ikke-invasivt værktøj til at fuldføre kvalitetsvurderingen af hornhinden, især stroma (inklusive Bowmans lag). I modsætning til under undersøgelse af spaltelamper forbliver transplantatet nedsænket i et lukket kammer fyldt med lagringsmedium under hele FF-OCM-billedoptagelsen, hvilket reducerer enhver potentiel risiko for kontaminering.
For at opnå et vellykket billedbillede med FF-OCM (se materialetabellen) er det vigtigt, at mikroskopmålet er godt nedsænket i den optiske gel, der påføres oven på prøveholderens dæksel (trin 2.2.3). Det anbefales endvidere regelmæssigt at kontrollere kalibreringen af enheden, en procedure, der også skal udføres efter mislykket automatisk justering (trin 2.2.2) og åbnes via “Værktøjer og indstillinger” i anskaffelsessoftwaren (se materialetabel). Proceduren, som indebærer anvendelse af et kalibreringsspejl i prøveholderen, er den samme som den sædvanlige prøveforberedelse (se trin 1.2), bortset fra at den optiske gel skal påføres spejlet, før dækslet placeres.
En række donorhornhindetransplantater, der anses for at have normal stroma i henhold til eksisterende øjenbankprocedurer, blev brugt til at beskrive protokollen i dette manuskript og specifikt demonstrere FF-OCM’s egnethed til præcis og pålidelig vurdering af donorstromal kvalitet. Disse normale donorhornhinder blev sammenlignet med patologiske hornhinder nedsænket i opbevaringsmedium, hvilket viser, at den histologilignende analyse, der blev muliggjort med FF-OCM af flere stromale træk (illustreret i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8) i hornhindetransplantater, gør det muligt at skelne syge fra normalt humant hornhindevæv.
Bortset fra morfologiske ændringer, såsom tilstedeværelsen af ar (figur 5 og figur 7), fibrotisk væv (figur 8), søer (figur 2), Vogt striae (figur 4) eller øget stromal nervediameter (figur 4), er typiske stromale træk til stede i syge hornhinder. Stromaparametre, der er særligt relevante i stromalkvalitetsvurderingen, synes at være Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet samt stromal reflektionsevne. Kritiske trin i protokollen er således trin 4.1 og 4.3.
Mens det udskilles under menneskelig hornhindeudvikling, bliver især Bowmans lag tydeligt ved 19 ugers svangerskab og repareres aldrig efter fødslen32. Skader på Bowmans lag er således irreversible og tjener som en ideel indikator for tidligere stromal skade i donorhornhindevæv, herunder skader forårsaget af brydningskirurgi, infektiøs keratitis, keratoconus. Sådanne hornhindesygdomme, som udgør kontraindikationer for donorhornhindebrug, er forbundet med nedsat og variabel lagtykkelse på grund af afbrydelse og ardannelse (figur 5) og vil sandsynligvis blive savnet af nuværende øjenbankprotokoller, når donorhistorien ikke er præcist kendt.
Selvom hornhindens gennemsigtighed er svækket efter donordød på grund af post mortem hornhindeødem, forventes mængden af tilbagespredt lys eller stromal reflektionsevne at falde eksponentielt med dybden i stroma (se figur 3 og figur 4A); som et resultat vil logaritmen til normaliseret stromal reflektivitet være en lineær funktion af stromal dybde i normale donorhornhinder, repræsenteret af R-kvadratværdier tæt på 1. Omvendt er tilstedeværelsen af makroskopiske træk forbundet med ikke-lineære logaritmiske dybdeprofiler og indikerer stromal sygdom (figur 4B og figur 7)25.
Da keratocytdensitet er ansvarlig for stromal kollagenfibril og ekstracellulær matrixsyntese og fornyelse, synes det rimeligt at antage, at keratocytdensitet er en anden relevant parameter til vurdering af donorstromal kvalitet, og at væv med meget lave keratocyttal ikke bør transplanteres. Protokollen indeholder derfor en præcis og pålidelig metode til måling af keratocytdensitet fra FF-OCM-billeder, der let kan bruges i øjenbanker25 og følger konventionen om konfokal mikroskopi. Bemærk, at med FF-OCM kan keratocytdensitet også bestemmes ved at tælle keratocytter direkte i tværsnitsbilledet33, en potentiel fordel i forhold til konfokal mikroskopi, som kræver, at keratocytter tælles på flere ansigtsskiver. I modsætning til hos levende patienter, hvor keratocyttætheden har vist sig at være lavere hos sygdomspatienter end hos normale kontroller 34,35,36,37 og at korrelere med sygdommens sværhedsgrad 34,38, var dette imidlertid ikke tilfældet i humane ex vivo-vævsprøver 25 , og yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om der kræves et minimalt antal keratocytter i donorhornhinden for at resultere i god visuel genopretning efter transplantation. Lav keratocyttæthed i donorvæv som i patologisk væv kan forklares ved aldring, post mortem tab af celler induceret af iskæmi og/eller opbevaring af donorvæv 27,39,40,41. Det skal også påpeges, at de normale donorhornhinder, der blev opnået og afbildet i denne protokol, enten blev opbevaret og edematøse eller svulmet op eller var blevet kasseret af øjenbanken før transplantation på grund af dårlig endotelkvalitet i henhold til standarderne fra EU Eye Bank Association. Hvis FF-OCM-billeddannelse sammen med den beskrevne protokol skulle inkluderes i øjenbankindstillingen, ville hornhinderne typisk blive vurderet i en friskere tilstand, end det var muligt her, hvilket kan påvirke keratocyttæthederne.
Den her beskrevne protokol for stromalkvalitetsanalysen kunne udvides til vurdering af Descemets membran, som også kan løses med FF-OCM med hensyn til tykkelse og struktur21,24. Dette kan vise sig nyttigt til udvælgelse af væv til Descemets membranendotelkeratoplastik, hvor tynde Descemets membraner kan være vanskeligere at adskille fra stroma.
Afslutningsvis muliggør FF-OCM præcis og pålidelig vurdering af humant donorhornhindestroma under opbevaring. Ved at forbedre transplantatkvaliteten har tilføjelsen af denne protokol til de nuværende øjenbankprocedurer potentialet til at forbedre screening og udvælgelse af donorvæv og dermed resultaterne af keratoplastik. Reel integration af FF-OCM-enheden i øjenbankrutinen bør lettes af nylige teknologiske opdateringer, herunder hurtigere billedoptagelse og større synsfelt takket være udviklingen af et brugerdefineret CMOS-kamera og design af brugerdefinerede sterile engangskassetter til hornhindeopbevaring og håndtering under billeddannelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde har modtaget støtte fra Agence Nationale de Recherche (ANR), under et PRTS-tilskud (Projet de Recherche Translationelle en Santé) nr. ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) og fra EU’s forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 709104 (K.I.). Forfatterne takker Céline de Sousa for hjælp med celletælling og histologisk behandling.
Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |