Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)
Summary
Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.
Abstract
Die Montage von Proteinkomplexen ist ein zentraler Mechanismus zugrunde liegt die Regulierung der vielen Zelle Signalwege. Ein wichtiger Schwerpunkt der biomedizinischen Forschung ist entziffern, wie diese dynamische Proteinkomplexe handeln, um Signale aus mehreren Quellen um eine spezifische biologische Reaktion direkt zu integrieren, und wie dies in vielen Krankheit Einstellungen dereguliert wird. Trotz der Bedeutung dieses wichtigen biochemischen Mechanismus gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken, die die spezifisch und sensitiv Dekonvolution dieser Multi-Molekulare Signalisierung komplexe erleichtern können.
Hier richtet sich dieses Manko durch die Kombination eines Protein-Ergänzung-Assays mit einer Konformation-spezifische gemeinnützige, die wir Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP) bezeichnet haben. Diese neuartige Technik ermöglicht die spezielle Isolierung und nachgelagerten Proteomic Charakterisierung jedes Paar von interagierenden Proteine, unter Ausschluss des un-komplexiert einzelne Proteine und komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.
BiCAP-Technik ist anpassungsfähig an eine breite Palette von nachgelagerten experimentelle Tests und der hohe Grad an Spezifität bot durch diese Technik ermöglicht mehr differenzierte Untersuchungen in die Mechanik der Protein komplexen Baugruppe als derzeit möglich ist mit Standard-Affinität Reinigungstechniken.
Introduction
Protein-komplexen Baugruppe ist ein Schlüsselprozess bei der Aufrechterhaltung der raumzeitlichen Spezifität von vielen Signalisierung Wege1,2. Während die kritische Natur dieser regulatorische Rolle allgemein anerkannt ist, gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken zur Verfügung, um diese komplexe unter die Lupe nehmen. Die meisten phänotypische Studien konzentrieren sich auf Interaktionen mit einzelne Proteine oder die sequentielle Bereicherung einzelner komplexe Komponenten. Hier präsentieren wir eine Technik für die Isolierung von einem spezifischen Protein-Dimer, während mit Ausnahme der einzelnen Moieties Komponente Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden verbindliche Partner3gebildet. Wir haben diese Technik namens Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP), es ist eine Kombination eines bereits vorhandenen Protein Fragment Komplementierung Assays, Bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC), mit dem neuartigen Einsatz von einer Konformation-spezifische rekombinante gemeinnützige GFP und seine Derivate (siehe Table of Materials).
Ein typische Protein-Fragment Komplementierung Assay stützt sich auf den Ausdruck der “Köder” und “Beute” Proteine verschmolzen um Fragmente der Reporter wie Luciferase4, β-Galaktosidase5oder grün fluoreszierendes Protein (GFP)6 ( teilen Abbildung 1A). Durch das Zusammenspiel der Köder und Beute Proteine sollen die Split-Reporter-Domänen in eine funktionale Struktur, so dass die Interaktion des Köders Umfalten und Beute Proteine visualisiert oder quantifiziert werden. BiCAP wurde von einer Version dieser Technik, die aus der Fragmente der GFP Variante Venus verwenden. Fluoreszierendes Protein-Ergänzung-Assays sind eine beliebte Methode zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in einer live-Zelle, aber bis jetzt wurden auf diese eine Funktion7beschränkt. BiCAP stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Hinsicht, da diese Technik nicht nur zur Visualisierung, aber auch die Isolation und Verhöre der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktion erlaubt.
Abbildung 1: die strukturelle wichtigsten hinter die BiCAP Technik. (A) ein Schema skizziert die wichtigsten hinter Bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung zeigt “bait” und “Beute” Proteine mit der N-terminalen V1 oder V2 C-terminale Fragmente des Full-Length Venus Proteins markiert. (B) strukturelle Analyse der Interaktion (Cyan) Schnittstelle zwischen der GFP gemeinnützige (grün) und rekombinierte Venus, welche die Position der (grau) V1 und V2 (orange) Fragmente (PDB Beitritt 3OGO). Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
BiCAP macht Technik verwenden zwei nicht fluoreszierenden Fragmente der Venus (benannt V1 und V2), die mit einem niedrigen Grad von Affinität zu verbinden, es sei denn, eine Interaktion zwischen ihrer Fusion Partner auftritt. In diesem Fall Einspritzen die beiden geteilten Domains in die funktionale β-Fass-Struktur der Fluorophor (Abbildung 1 b)6. Die entscheidende Neuerung des BiCAP stammt aus der Einführung des rekombinanten GFP-gemeinnützige, die eine dreidimensionale Epitop auf dem β-Fass GFP (und Varianten wie Venus) erkennt, die nur auf die korrekt rekombinierte und gefalteten Fluorophor ( vorhanden ist Abbildung 1 b)8. Entscheidend ist, bindet die GFP gemeinnützige nicht entweder die einzelnen Fragmente der Venus. Dies erleichtert die Isolierung von Proteinen Dimere erst, nachdem die beiden Proteine, einen Komplex aus eigenem Antrieb gebildet haben, führt zu mehr repräsentative Ergebnisse als die erworbenen aus Methoden, die machen von chemisch induzierten, erzwungene Interaktionen9verwenden.
BiCAP ist eine leistungsstarke Technik, die speziell auf Multi-Protein-komplexe, die potenziell können, mit einer Anzahl von downstream-Anwendungen kombiniert werden, die Granularität der unser Verständnis von der Rolle zu verbessern, die diese komplexe in der Signaltransduktion spielen . Es umfasst auch das wichtige Merkmal der Visualisierung von Protein-Interaktionen in Situermöglicht. Bis heute BiCAP als eine wirksame Methode zur Analyse der Interaktom von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Dimere3nachgewiesen, aber die Anpassungsfähigkeit dieser Methode bedeutet, dass es in fast jedem Protein Interaktion Kontext angenommen werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiCAP ist eine leistungsfähige Methode zur Isolierung von spezifischen Proteins Dimere beim Ausschließen der einzelnen Komponenten und ihre konkurrierende verbindliche Partner3. BiCAP basiert auf Anpassung eines Fluoreszenz Protein-Ergänzung Assays BiFC6genannt. Bestehende Methoden, einschließlich BiFC und Nähe Ligatur-Assays, zu visualisieren und zu quantifizieren, Protein-Interaktionen in lebenden Zellen7ausgiebig, aber kein wirksames Mittel z…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.R.C ist Krebs Institut NSW Fellow und D.N.S war zuvor Mitglied Cancer Institute New South Wales. Die Forschungsergebnisse präsentiert in dieser Handschrift wurden von Cancer Institute New South Wales (13/FRL/1-02 und 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), New South Wales Office of Science und medizinische Forschung, Gastfamilie finanziert. Gemeinschaft und Mostyn Family Foundation. Empfänger eines australischen Postgraduate Awards waren J.F.H. und R.S.
Materials
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid – Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) – 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
Referências
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