Пройдя через сигнализации различных белковых комплексов, очищение сродства Bimolecular дополнения (BiCAP)
Summary
Эта рукопись описывает протокол для Bimolecular очищение сродства комплементарности (BiCAP). Этот новый метод облегчает конкретные изоляции и вниз по течению proteomic характеристик любых двух взаимодействующих белков, хотя исключая ООН complexed индивидуальных белков, а также комплексы с конкурирующими привязки партнерами.
Abstract
Ассамблея белковых комплексов является центральный механизм, лежащий в основе регуляции многих клеток, сигнальные пути. Одним из основных направлений биомедицинских исследований расшифровка как эти динамические белковых комплексов действовать, чтобы интегрировать сигналы от нескольких источников для того, чтобы направлять конкретные биологической реакции, и как это становится дерегулируемых во многих заболеваний. Несмотря на важность этой ключевой биохимического механизма является отсутствие экспериментальных методов, которые могут способствовать конкретные и чувствительной деконволюция этих различных молекулярных комплексов сигнализации.
Здесь этот недостаток решается благодаря сочетанию комплементарности assay протеина с конформации конкретных наночастицы, которые мы называем Bimolecular очищение сродства комплементарности (BiCAP). Этот роман технику облегчает конкретные изоляции и ниже по течению proteomic характеристика любой пары взаимодействующих белков, к исключению ООН complexed индивидуальных белков и комплексов, сформированные с конкурирующими привязки партнерами.
BiCAP техника адаптируется к широкий спектр течению экспериментальных анализов, и высокая степень конкретности, обеспечиваемой этой техники позволяет более тонкий расследования механики сложных Ассамблеи белка, чем это возможно в настоящее время с помощью Стандарт соответствия методов очистки.
Introduction
Белка комплекс Ассамблея представляет собой ключевой процесс в поддержании пространственно-временных специфику многих сигнальных путей1,2. Хотя широко признается критический характер этой нормативной роли, есть отсутствие экспериментальных методов, доступных для изучения этих комплексов. Большинство interactomics исследования сосредоточены на взаимодействии с отдельными белками, или последовательного обогащения отдельных компонентов комплекса. Здесь мы представляем технику для изоляции определенных белков димер, хотя исключая отдельных постановление компонент белков, а также комплексы с конкурирующих обязательными партнерами3. Мы назвали эту технику Bimolecular очищение сродства комплементарности (BiCAP), как он представляет собой сочетание пробирного ранее существующие дополнения фрагмент белка, Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ), с использованием Роман конформации конкретных рекомбинантных наночастицы GFP и его производные (см. таблица материалов).
Типичный белка фрагмент комплементарности пробирного опирается на выражение «приманки» и «жертвой» белки, склеенный разделить фрагменты репортеров Люцифераза4, β-галактозидазы5или Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)6 ( Рисунок 1A). Путем взаимодействия белков приманку и добычу Сплит репортер домены предлагается сворачивают в функциональной структуры, позволяя взаимодействие приманку и prey протеины быть визуализированы или количественно. BiCAP был адаптирован от версии этого метода, который сделал использование фрагментов GFP вариант Венеры. Флуоресцентный белок комплементарности анализов являются популярным методом для визуализации белок белковых взаимодействий в живой клетке, но до сих пор были ограничены в этой одной функции7. BiCAP представляет собой значительный шаг вперед в этом отношении, как эта техника позволяет не только для визуализации, а также изоляции и допроса в результате взаимодействия протеин протеина.
Рисунок 1: структурная основным за технику BiCAP. (A) изложением основным за bimolecular флуоресценции дополнения показаны схема «наживки» и «prey» белки отмеченных N-терминальный V1 или V2 C-терминала фрагменты полнометражного Венера белка. (B) структурный анализ взаимодействия интерфейса (голубой) между GFP наночастицы (зеленый) и рекомбинированные Венеры, показывающий положение (серый) V1 и V2 (оранжевый) фрагменты (PDB 3OGO присоединения). Эта цифра составляет перепечатаны fromCroucher et al.3 печатается с разрешения AAAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
BiCAP техника делает использование двух фрагментов не флуоресцентные Венеры (названный V1 и V2), которые связывают с низкой степенью родства, если происходит взаимодействие между партнерами их слияние. В этом случае две Сплит домены сворачивают в функциональную структуру β-баррель Флюорофор (рис. 1B)6. Основные инновации BiCAP приходит от введение рекомбинантных GFP наночастицы, который признает трехмерной epitope на β-баррель GFP (и такие варианты, как Венера), который присутствует только на правильно рекомбинированные и сложил Флюорофор ( Рисунок 1B)8. Самое главное GFP наночастицы не привязан к любой из отдельных фрагментов Венеры. Это облегчает изоляции белка димеры, только после того, как две белки сформировался комплекс по собственной воле, приводит к более репрезентативных результатов, чем тех, кто приобрел от методов, которые делают использование химически индуцированных, насильственных взаимодействий9.
BiCAP – это мощный метод, который специально посвящен мульти белковых комплексов, которые потенциально могут быть объединены с рядом нисходящие приложения для улучшения детализации нашего понимания той роли, которую играют эти комплексы в сигнальной трансдукции . Она также охватывает важную особенность позволяет визуализации белковых взаимодействий в situ. BiCAP до настоящего времени, было продемонстрировано как эффективный метод анализа interactome рецепторов тирозин киназы (РТК) димеры3, но и способность этого метода означает, что он может быть принят в контексте взаимодействия практически любого белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiCAP это мощный метод для изоляции определенных белков димеры исключая отдельные компоненты и их конкурирующих привязки партнеров3. BiCAP основана на адаптации флуоресценции белков комплементарности пробирного под названием БМФЦ6. Существующие методы, включая Б…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.R.C является членом NSW институт рака и D.N.S ранее был стипендиатом NSW институт рака. Результаты исследований представлены в этой рукописи финансировались NSW институт рака (13/FRL/1-02 и 09/Кор/2-39), NHMRC (проект Grant GNT1052963), фонд науки Ирландии (11/СИРГ/B2157), NSW Управления по науке и медицинских исследований, гостевые семьи Стипендии и Фонд Mostyn семьи. J.F.H. и р.с. были получателями австралийской последипломного Award.
Materials
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid – Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) – 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
Referências
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
- Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69 (2016).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
- Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690 (2017).
