Generation af monoklonale antistoffer mod naturprodukter
Summary
Denne artikel giver en detaljeret protokol for forberedelse og evaluering af monoklonale antistoffer mod naturlige produkter til brug i forskellige immunassays. Denne procedure omfatter vaccination, cellefusion, indirekte konkurrerende ELISA for positive klon screening og monoklonale hybridom forberedelse. Specifikationer for antistof karakterisering ved hjælp af MALDI-TOF-MS og ELISA analyser er også tilgængelige.
Abstract
Analysen af de bioaktive komponenter i fødevarer og naturlige produkter er blevet et populært område af undersøgelse i mange områder, herunder traditionel kinesisk medicin og fødevarer sikkerhed/toksikologi. Mange af de klassiske analyseteknikker kræver dyrt udstyr og/eller ekspertise. Navnlig, er enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) blevet en nye metode til analyse af fødevarer og naturlige produkter. Denne metode er baseret på antistof-medieret påvisning af target-komponenter. Men som mange af de bioaktive komponenter i naturlige produkter er små (< 1000 Da) og ikke fremkalde en immunrespons, oprettelse af monoklonale antistoffer (papagøjesyge) mod dem er ofte vanskelig. I denne protokol giver vi en detaljeret redegørelse for de foranstaltninger til at generere mAbs mod målmolekyler samt de nødvendige for at oprette tilknyttede indirekte konkurrencedygtige (ic) ELISA til hurtig analyse af sammensat i flere prøver. Proceduren beskriver syntese af den kunstige antigen (dvs. hapten-carrier konjugat), immunisering, cellefusion, monoklonale hybridom forberedelse, karakterisering af mAb og ELISA-baserede anvendelsen af mAb. Hapten-carrier konjugat blev syntetiseret af natrium periodate metode og evalueret af MALDI-TOF-MS. Efter immunisering, splenocytes blev isoleret fra immuniserede mus med den højeste antistof titer og sammenvoksede med hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) – følsomme mus myelomatose cellelinie Sp2/0 – Ag14 ved hjælp af en polyethylenglycol (PEG)-baseret metode. Hybridomer secernerende mAbs reaktiv til target-antigen blev screenet ved icELISA for specificitet og krydsreaktivitet. Desuden, den begrænsende fortynding metode blev anvendt til at forberede monoklonale hybridomer. De endelige mAbs blev yderligere karakteriseret ved icELISA og derefter udnyttes i et ELISA-baseret program til hurtig og bekvem påvisning af eksempel hapten (naringin (NAR)) i naturprodukter.
Introduction
Monoklonale antistoffer (papagøjesyge), også kendt som mono-specifikke antistoffer, er fremstillet af et enkelt B-lymphocyte klon og er sammensat af monovalent antistoffer at alle binder sig til den samme epitop1. I de seneste år, har været brugt mange plante-afledt naturlige lægemidler til behandling af forskellige sygdomme2. Faktisk, mange små molekylære forbindelser oprindeligt stammer fra naturlige produkter anvendes nu som første-line lægemidler, såsom artemisinin mod malaria og paciltaxel (taxol) for kræft2,3. Undersøgelse af naturlige produkter har gjort hurtige fremskridt, hovedsagelig på grund af den enorme udvikling og optimering af konventionelle analyseteknikker, herunder højtryksvæskekromatografi (HPLC) samt massespektrometri (MS). Men der er stadig nogle begrænsninger i forbindelse med disse metoder, såsom deres komplekse forbehandling protokoller og dermed forbundne omkostninger med hensyn til tid, labor/ekspertise og nødvendige instrumenter4.
For nylig, mAb-baserede enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) er blevet anvendt for kvalitativt og kvantitativt at analysere fødevarer og naturlige produkter. I virkeligheden, denne metode er blevet anvendt til både biologiske prøver analyse og klinisk afprøvning og har vist sig at være præcise, følsomme og meget effektiv samtidig også undgå de kedelige forbehandling trin forbundet med andre analyser5, 6.
Når du bruger mAb-baserede ringprøver for at studere komplekse naturprodukter, er forberedelse af monoklonale antistoffer et af de centrale trin. Desværre, den mAbs specifikke til de lille bioaktive komponenter i disse typer af stoffer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 er ofte begrænsede i forhold til protein antigener. For at omgå dette problem, har vi udviklet en protokol til at specifikt generere mAbs mod små forbindelser. Protokollen præsenteres her indeholder kunstige antigen syntese, mus immunisering, cellefusion, indirekte konkurrerende ELISA og monoklonale hybridom forberedelse.
Navnlig, har vores forskergruppe at studere dannelsen af mAbs mod små bioaktive stoffer fra traditionel kinesisk medicin og udvikle deres programmer for år. I vores igangværende undersøgelser, har vi udviklet mAbs mod baicalin16, puerarin17, et syre18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121og mange andre små molekyler. Vores ELISA protokoller baseret på disse mAbs har været brugt i en række undersøgelser for at vurdere farmakokinetik af disse små molekyler samt deres interaktioner med andre bioaktive stoffer. Derudover har bruger disse mAbs, vi også udviklet immunoaffinity kromatografi metoder til adskillelse af strukturelle analogstoffer deraf, herunder epimers. For nylig har forberedt vi en immunassay baseret på lateral strømning ved hjælp af vores anti-puerarin-mAb, der blev senere brugt til hurtige, on-site detektion af dette stof. Vores resultater viser, at vores mAb-baserede assays er uundværlig og praktiske værktøjer til at studere biologi og kvalitet af naturlige-produkt-afledte forbindelser, især dem, der anvendes i traditionel kinesisk medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her, en protokol for den vellykkede produktion af mAbs mod naturlige produkt, der stammer små molekyler. De afgørende trin i proceduren er blevet skitseret, og vi har vist nytten af denne protokol bruger NAR som et eksempel lille molekyle. Eksempel spektre, reaktivitet analyser og icELISA resultater viser alle repræsentant eksperimentelle og kontroldata, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol. Eksempler på billeder af hybridomer give en visuel repræsentation af hvad forskeren bør være på …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (grant numre 81573573, 81473338 og 81503344) og klassisk recept grundlæggende forskning hold på Beijing Universitet i kinesisk medicin.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
