جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية
Summary
توفر هذه المقالة بروتوكول مفصلة لإعداد وتقييم للأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية لاستخدامها في مختلف تحديدكم. ويشمل هذا الإجراء التحصين، خلية الانصهار، أليسا المنافسة غير المباشرة لاستنساخ إيجابية الفحص، وإعداد هيبريدوما [مونوكلونل]. كما يتم توفير مواصفات جسم توصيف استخدام استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد وتحليل إليزا.
Abstract
تحليل المكونات النشطة بيولوجيا في الأطعمة والمنتجات الطبيعية أصبحت منطقة شعبية للدراسة في العديد من المجالات، بما في ذلك التقليدية الصينية الدواء والغذاء السلامة/علم السموم. تتطلب العديد من تقنيات التحليل الكلاسيكي معدات غالية الثمن و/أو الخبرة. جدير بالذكر أن فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط (الساس) أصبحت أسلوب ناشئة لتحليل الأطعمة والمنتجات الطبيعية. يستند هذا الأسلوب إلى الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة من مكونات الهدف. ومع ذلك، كالعديد من المكونات النشطة بيولوجيا في المنتجات الطبيعية هي صغيرة (< دا 1,000) والحث على عدم استجابة مناعية، وغالباً ما يصعب إيجاد الأجسام المضادة (مابس) ضدهم. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم شرحاً مفصلاً للخطوات المطلوبة لإنشاء مابس ضد الجزيئات المستهدفة، فضلا عن تلك المطلوبة لإنشاء المرتبطة بها غير المباشرة التنافسية (ic) أليسا للتحليل السريع للمجمع في عينات متعددة. يصف الإجراء توليف مستضد اصطناعية (أي، المتقارن هابتين الناقل)، التحصين، خلية الانصهار، إعداد هيبريدوما [مونوكلونل]، وصف الإنسان والمحيط الحيوي، وتطبيق المستندة إلى أليسا الإنسان والمحيط الحيوي. المتقارن هابتين الناقل تم تصنيعه بالصوديوم فوق يودات الأسلوب وتقييمه بواسطة استخدام TOF-مللي ثانية. بعد التحصين، بمعزل عن الماوس المحصنين مع عيار الأجسام المضادة أعلى سبلينوسيتيس وتنصهر مع Ag14 (القبعة)–ماوس حساسة الورم النخاعي الخلية خط Sp2/0-هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-التريتيوم استخدام البولي إيثيلين غليكول (شماعة)-على أساس الأسلوب. تم فحص هيبريدوماس إفراز مابس رد الفعل على مستضد الهدف من إيسيليسا لخصوصية وه. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق الأسلوب إضعاف الحد لإعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]. كذلك اتسمت إيسيليسا مابس النهائي وثم استخدامها في أحد تطبيقات المستندة إلى إليزا للكشف السريع ومريحة هابتين مثال (نارينجين (NAR)) في المنتجات الطبيعية.
Introduction
مونوكلونل (مابس)، يعرف أيضا باسم الأجسام المضادة أحادية محددة، يتم إنتاجها من استنساخ بليمفوسيتي واحدة وتتألف من الأجسام المضادة الفموي الأحادي التكافؤ أن كل ربط حانمه نفس1. في السنوات الأخيرة، استخدمت العديد من المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات الطبية في علاج الأمراض المختلفة2. وفي الواقع، تطبق الآن العديد من المركبات الجزيئية الصغيرة مستمد أصلاً من المنتجات الطبيعية كأدوية الخط الأول، مثل مادة الأرتيميسينين لعلاج الملاريا وباسيلتاكسيل (تاكسول) للسرطان2،3. دراسة المنتجات الطبيعية حققت تقدما سريعاً، إلى حد كبير بسبب تنمية هائلة والاستغلال الأمثل لتقنيات التحليل التقليدي، بما في ذلك كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) والطيف الكتلي (مللي ثانية). ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود المرتبطة بهذه الأساليب، مثل بروتوكولات المعالجة المعقدة والتكاليف المرتبطة بها فيما يتعلق بالوقت والعمل/الخبرة والأدوات المطلوبة4.
في الآونة الأخيرة، طبقت الاختبارات المستندة إلى ماب الممتز المرتبط بالانزيم (الساس) على كمياً ونوعيا في تحليل المواد الغذائية والمنتجات الطبيعية. في الواقع، هذا الأسلوب قد طبقت لتحليل العينات البيولوجية والتجارب السريرية وقد تبين أن تكون دقيقة وحساسة وذات كفاءة عالية في حين أيضا تجنب الخطوات مملة المعالجة المسبقة المرتبطة ب التحاليل الأخرى5، 6.
عند استخدام الساس ماب المستندة إلى دراسة المنتجات الطبيعية المعقدة، إعداد الأجسام المضادة واحدة من الخطوات الأساسية. ولسوء الحظ، مابس الخاصة بالمكونات النشطة بيولوجيا الصغيرة الموجودة في هذه الأنواع من المواد6،،من78،،من910،11،12 13، ،،من1415 غالباً ما تكون محدودة مقارنة بمولدات المضادات البروتين. للالتفاف حول هذه المسألة، وقد وضعنا بروتوكولا لإنشاء مابس ضد المركبات الصغيرة على وجه التحديد. يشمل البروتوكول المعروضة هنا التوليف مستضد اصطناعية الماوس، خلية الانصهار، ELISA التنافسية غير المباشرة والتحصين والإعداد هيبريدوما [مونوكلونل].
جدير بالذكر أن دراسة تشكيل مابس ضد المركبات النشطة بيولوجيا الصغيرة من الأدوية الصينية التقليدية لدينا مجموعة بحوث وتطوير التطبيقات الخاصة بهم لسنوات. وقد وضعنا في دراساتنا الجارية، مابس ضد بايكالين16، بويرارين17، وحامض glycyrrhizic18، بايونيفلورين19، جنسنوسد Re20، جنسنوسد Rh121والعديد من الجزيئات الصغيرة الأخرى. لدينا بروتوكولات أليسا استناداً إلى هذه مابس قد استخدمت في عدد من الدراسات لتقييم الدوائية هذه الجزيئات الصغيرة، فضلا عن تفاعلها مع غيرها من المركبات النشطة بيولوجيا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذه مابس، قد وضعنا أيضا أساليب اللوني إيمونوافينيتي لفصل نظائر الهيكلية، بما في ذلك ابيميرس. في الآونة الأخيرة، أعددنا المناعة تدفق أفقي استخدام لدينا ماب بويرارين المضادة التي استخدمت فيما بعد للكشف السريع، في الموقع لهذا المركب. نتائجنا تشير إلى أن لدينا فحوصات المستندة إلى ماب أدوات لا غنى عنها ومريحة لدراسة علم الأحياء ونوعية المركبات المشتقة من المنتجات الطبيعية، وخاصة تلك المستخدمة في الأدوية الصينية التقليدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا، بروتوكولا للنجاح في إنتاج مابس ضد الجزيئات الصغيرة الطبيعية المستمدة من المنتج. وقد أوجزت الخطوات الأساسية في الإجراء، وإننا قد أثبتت فائدة هذا البروتوكول استخدام نار كجزيء صغير مثال. المثال الأطياف وتحليلات مفاعليه، ونتائج إيسيليسا جميع إظهار الممثل التجريبية وبيانات التحكم…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل الكلاسيكي الوصفة الأساسية فريق البحث بجامعة بكين “الطب الصيني” ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (منحة الأرقام 81573573 و 81473338 و 81503344).
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
