Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten
Summary
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.
Abstract
De analyse van de bioactieve componenten aanwezig zijn in de voedingsmiddelen en natuurlijke producten uitgegroeid tot een populaire gebied van studie op vele terreinen, met inbegrip van traditionele Chinese geneeskunde en voedsel veiligheid/toxicologie. Veel van de klassieke analysetechnieken vereisen dure apparatuur en/of expertise. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) geworden met name, een nieuwe methode voor de analyse van de voedingsmiddelen en natuurlijke producten. Deze methode is gebaseerd op antilichaam-gemedieerde detectie van de doel-componenten. Echter, zoals veel van de bioactieve componenten in natuurlijke producten zijn klein (< 1.000 Da) en doen niet het opwekken van een immuunrespons, het creëren van monoclonal antilichamen (mAbs) tegen hen is vaak moeilijk. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde uitleg over de stappen die nodig zijn voor het genereren van mAbs tegen doel moleculen, alsmede degenen die nodig zijn voor het maken van de bijbehorende indirecte concurrerende (ic) ELISA voor de snelle analyse van de stof in meerdere monsters. De procedure wordt beschreven voor de synthese van de kunstmatige antigeen (dat wil zeggen, de geconjugeerde hapten-carrier) immunisatie, celfusie, monoklonaal hybridoma voorbereiding, karakterisatie van de mAb, en de ELISA gebaseerde toepassing van de mAb. De geconjugeerde hapten-carrier werd gesynthetiseerd door de natrium Perjodaat methode en geëvalueerd door de MALDI-TOF-MS. Na immunisatie, splenocytes werden geïsoleerd van de geïmmuniseerde muis met de hoogste antilichaam titer en gesmolten met de hypoxanthine-aminopterin-thymidine (hoed) – gevoelige muis myeloma cellijn Sp2/0 – Ag14 met behulp van een polyethyleenglycol (PEG)-op basis van de methode. De hybridomas afscheidende mAbs reactieve aan de target-antigeen waren gescreend door de icELISA voor de specificiteit en Kruisallergie. Bovendien, de beperkende verdunning-methode werd toegepast om te bereiden monoclonal hybridomas. De definitieve mAbs waren verder gekenmerkt door icELISA en vervolgens gebruikt in een ELISA gebaseerde toepassing voor de snelle en gemakkelijke opsporing van de voorbeeld hapten (naringin (NAR)) in natuurlijke producten.
Introduction
Monoclonal antilichamen (mAbs), ook bekend als mono-specifieke antistoffen, geproduceerd door een enkele lymfocyt kloon en zijn samengesteld uit monovalent antilichamen die alle aan hetzelfde epitoop1 koppelt. In de afgelopen jaren hebben vele plantgerelateerde natuurlijke geneesmiddelen gebruikt bij de behandeling van verschillende ziekten2. Inderdaad, veel kleine moleculaire verbindingen oorspronkelijk afgeleid van natuurlijke producten zijn nu toegepast als eerstelijns drugs, zoals artemisinine tegen malaria en paciltaxel (taxol) voor kanker2,3. De studie van natuurlijke producten heeft snelle vorderingen gemaakt, grotendeels te wijten aan de enorme ontwikkeling en optimalisatie van conventionele analysetechnieken, met inbegrip van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en massaspectrometrie (MS). Er zijn echter nog enkele beperkingen die zijn gekoppeld aan deze methoden, zoals hun complexe voorbehandelingsplatformen protocollen en kosten met betrekking tot tijd, arbeid/expertise en vereiste instrumenten4.
Onlangs, mAb gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) zijn toegepast om kwalitatief en kwantitatief te analyseren voedingsmiddelen en natuurlijke producten. In feite, deze methode is toegepast bij zowel biologische monsters analyses en klinische tests en gebleken te zijn nauwkeurig, gevoelig en hoogefficiënte terwijl ook het vermijden van de vervelende voorbehandelingsplatformen stappen die zijn gekoppeld aan andere analyses5, 6.
Bij het gebruik van mAb gebaseerde ELISAs om te studeren van complexe natuurlijke producten, is voorbereiding van het monoclonal antilichamen een van de stappen van de kern. Helaas, de mAbs specifiek voor de kleine bioactieve componenten aanwezig zijn in dit soort stoffen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 zijn vaak beperkt in vergelijking met de eiwit antigenen. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een protocol voor het genereren van specifiek mAbs tegen kleine verbindingen. Het hier gepresenteerde protocol bevat kunstmatige antigeen synthese, muis immunisatie celfusie, indirecte competitieve ELISA en monoclonal hybridoma voorbereiding.
Met name is onze onderzoeksgroep het bestuderen van de vorming van mAbs tegen kleine bioactieve stoffen uit de traditionele Chinese medicijnen en ontwikkelen van hun toepassingen voor jaren. In onze aan de gang zijnde onderzoeken, hebben we mAbs tegen baicalin16, puerarin17, glycyrrizine zuur18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121en vele andere kleine moleculen. Onze ELISA-protocollen op basis van deze mAbs zijn gebruikt in een aantal studies om te evalueren van de farmacokinetiek van deze kleine moleculen, alsmede hun interacties met andere bioactieve stoffen. Bovendien, met behulp van deze mAbs, we hebben ook immunoaffinity chromatografie methodes ontwikkeld voor de scheiding van structuuranalogons daarvan, met inbegrip van epimers. Onlangs, wij bereid een laterale-flow-immunoassay met behulp van onze anti-puerarin mAb die vervolgens werd gebruikt voor snelle, on-site detectie van dit samengestelde. Onze resultaten wijzen erop dat onze mAb-gebaseerd testen onmisbaar en handige hulpmiddelen zijn voor de studie van de biologie en de kwaliteit van de natuurlijke product-afkomstige stoffen, met name die worden gebruikt in traditionele Chinese medicijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een protocol voor de succesvolle productie van mAbs tegen natuurlijke product afkomstige kleine moleculen. De essentiële stappen in de procedure hebben uitgestippeld, en we hebben laten zien het nut van dit protocol NAR gebruiken als een voorbeeld klein molecuul. De voorbeeld-spectra, reactiviteit analyses en resultaten van de icELISA alle Toon vertegenwoordiger experimentele gegevens en controles die wordt verkregen met behulp van dit protocol. Voorbeeld van de beelden van de hybridomas bieden een v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (subsidie nummers 81573573, 81473338 en 81503344) en het klassieke recept Basic onderzoeksteam aan de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
