प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन
Summary
यह लेख विभिंन immunoassays में उपयोग के लिए प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तैयारी और मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इस प्रक्रिया में प्रतिरक्षण, सेल फ्यूजन, सकारात्मक क्लोन स्क्रीनिंग के लिए अप्रत्यक्ष प्रतियोगी एलिसा, और मोनोक्लोनल हाइपरडोमा तैयार करना शामिल है । मालदी-TOF-MS और ELISA विश्लेषण का उपयोग कर एंटीबॉडी लक्षण वर्णन के लिए विनिर्देशों भी प्रदान किए जाते हैं ।
Abstract
खाद्य पदार्थों और प्राकृतिक उत्पादों में मौजूद जैव सक्रिय घटकों का विश्लेषण कई क्षेत्रों में अध्ययन का एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है, जिसमें पारंपरिक चीनी चिकित्सा और खाद्य सुरक्षा/ शास्त्रीय विश्लेषण तकनीकों के कई महंगे उपकरण और/ विशेष रूप से, एन्जाइम-लिंक्ड इमयूनोसोमोंट असेस (एलिसस) खाद्य पदार्थों और प्राकृतिक उत्पादों के विश्लेषण के लिए एक उभरती हुई पद्धति बन गए हैं । इस विधि को लक्षित घटकों के एंटीबॉडी-mediated पता लगाने पर आधारित है । हालांकि, के रूप में प्राकृतिक उत्पादों में bioactive घटकों के कई छोटे है (< 1000 डीए) और एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा नहीं, उनके खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) बनाने अक्सर मुश्किल है । इस प्रोटोकॉल में, हम लक्ष्य अणुओं के खिलाफ mAbs उत्पंन करने के लिए आवश्यक चरणों का एक विस्तृत विवरण प्रदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन से जुड़े अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी (आईसी) ELISA कई नमूनों में यौगिक के तेजी से विश्लेषण के लिए बनाने की जरूरत है । प्रक्रिया कृत्रिम प्रतिजन के संश्लेषण का वर्णन (यानी, hapten वाहक संयुग्मी), प्रतिरक्षण, सेल फ्यूजन, मोनोक्लोनल संकर डोमा तैयारी, mab के लक्षण वर्णन, और elisa आधारित आवेदन mab. Hapten वाहक संयुग्मी सोडियम periodate विधि द्वारा संश्लेषित किया गया था और मालदी-TOF-MS द्वारा मूल्यांकन । प्रतिरक्षण के बाद, splenocytes एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) आधारित विधि का उपयोग करते हुए उच्चतम एंटीबॉडी अनुमापांक और hypoxanthine-aminopterin-थायमिडीन (HAT)-संवेदनशील माउस मायलोमा सेल लाइन Sp2/0-Ag14 के साथ संगलित के साथ प्रतिरक्षित माउस से अलग किए गए थे । लक्ष्य प्रतिजन के लिए अभिक्रियाशील mAbs रिएक्टिव संकरण को विशिष्टता और क्रॉस-जेट के लिए icELISA द्वारा प्रदर्शित किया गया था । इसके अलावा, सीमित तनुकरण विधि मोनोक्लोनल हाइब्रिड तैयार करने के लिए लागू किया गया था । अंतिम mAbs आगे icELISA द्वारा विशेषता और फिर एक ELISA आधारित आवेदन में उदाहरण hapten के तेजी से और सुविधाजनक पता लगाने के लिए उपयोग किया गया (naringin (नार)) प्राकृतिक उत्पादों में ।
Introduction
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs), भी मोनो विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में जाना जाता है, एक एकल बी-लिम्फोसाइट क्लोन से उत्पादित कर रहे हैं और एक ही epitope1के लिए सभी बाँध कि मोनोवेलेंट एंटीबॉडी से बना रहे हैं. हाल के वर्षों में कई औषधीय पादप व्युत्पन्न प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग विभिन्न रोगों के उपचार में किया गया है2. वास्तव में, कई छोटे आणविक यौगिकों मूल रूप से प्राकृतिक उत्पादों से व्युत्पंन अब पहली लाइन दवाओं के रूप में लागू कर रहे हैं, इस तरह के रूप में मलेरिया और paciltaxel के लिए आर्टेमिसिलिन (taxol) के लिए कैंसर2,3। प्राकृतिक उत्पादों के अध्ययन तेजी से प्रगति की है, मोटे तौर पर जबरदस्त विकास और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (HPLC) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) सहित पारंपरिक विश्लेषण तकनीकों के अनुकूलन के कारण । हालांकि, अभी भी कुछ इन विधियों, जैसे उनके जटिल pretreatment प्रोटोकॉल और संबंधित लागत के साथ जुड़े सीमाओं के साथ समय का संबंध है, श्रम/
हाल ही में, mAb-आधारित एंजाइम-लिंक्ड इमयूनोसोमोंट असयों (एलिसस) को गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से खाद्य और प्राकृतिक उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है । वास्तव में, इस विधि दोनों जैविक नमूनों विश्लेषण और नैदानिक परीक्षण के लिए लागू किया गया है और सही, संवेदनशील होना दिखाया गया है, और अत्यधिक कुशल जबकि भी थकाऊ pretreatment अंय विश्लेषण5के साथ जुड़े कदम से परहेज, 6.
जटिल प्राकृतिक उत्पादों का अध्ययन करने के लिए एमएबी आधारित एलिसस का उपयोग करते समय, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तैयारी मुख्य चरणों में से एक है । दुर्भाग्य से, छोटे bioactive पदार्थ के इन प्रकार में मौजूद घटकों के लिए विशेष mabs6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 अक्सर प्रोटीन एंटीजन की तुलना में सीमित हैं । इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, हम विशेष रूप से छोटे यौगिकों के खिलाफ mAbs उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकाल में कृत्रिम प्रतिजन संश्लेषण, माउस प्रतिरक्षण, कोशिका संलयन, अप्रत्यक्ष प्रतियोगी एलिसा, और मोनोक्लोनल हाइडोमा तैयार करना शामिल है ।
विशेष रूप से, हमारे अनुसंधान समूह के पारंपरिक चीनी दवाओं से छोटे bioactive यौगिकों के खिलाफ mAbs के गठन का अध्ययन किया गया है और वर्षों के लिए उनके अनुप्रयोगों के विकास । हमारे पर चल रहे अध्ययन में, हम बैकालीन16, puerarin17के खिलाफ mabs विकसित किया है, glycyrrhizic एसिड18, paeoniflorin19, जिनसेनोसाइड पुन:20, जिनसेनोसाइड Rh121, और कई अन्य छोटे अणुओं. इन mAbs पर आधारित हमारे ELISA प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है कई अध्ययनों में इन छोटे अणुओं के फार्माकोकोनेटिक्स का मूल्यांकन करने के साथ ही अन्य bioactive यौगिकों के साथ उनकी बातचीत. इसके अलावा, इन mAbs का उपयोग कर, हम भी epimers सहित संरचनात्मक analogues के पृथक्करण के लिए immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी विधियों का विकास किया है । हाल ही में, हम तैयार एक पार्श्व प्रवाह immunoassay हमारे विरोधी का उपयोग कर-puerarin mAb है कि बाद में तेजी के लिए इस्तेमाल किया गया था, इस परिसर का पता लगाने पर साइट । हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे mAb आधारित assays जीव विज्ञान और प्राकृतिक उत्पाद व्युत्पन्न यौगिकों की गुणवत्ता का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य और सुविधाजनक उपकरण हैं, विशेष रूप से पारंपरिक चीनी दवाओं में इस्तेमाल किया उन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम प्राकृतिक उत्पाद के खिलाफ mAbs के सफल उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत-छोटे अणुओं व्युत्पंन । प्रक्रिया में आवश्यक कदम को रेखांकित किया गया है, और हम एक उदाहरण छोटे अणु के रूप में नार का उपयोग …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ८१५७३५७३, ८१४७३३३८, और ८१५०३३४४) और चीनी चिकित्सा के बीजिंग विश्वविद्यालय में शास्त्रीय पर्चे बुनियादी अनुसंधान टीम द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
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