천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성
Summary
이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.
Abstract
식품 및 천연 제품에 생리 활성 구성 요소 분석 전통적인 중국 의학 및 식품 안전/독극물을 포함 한 많은 분야에서 연구의 인기 지역이 되었다. 고전 분석 기술의 많은 고가의 장비 및 전문 지식이 필요합니다. 특히, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 식품 및 천연 제품의 분석에 대 한 새로운 방법 되고있다. 이 방법은 항 체 중재 탐지 대상 구성 요소를 기반으로 합니다. 그러나, 많은 자연 제품에서 생리 활성 구성 요소는 작은 (< 1000 다)와 면역 반응을 유도 하지 마십시오, 그들에 대하여 단일 클론 항 체 (mAbs)을 만드는 것은 종종 어려운. 이 프로토콜 mAbs에 대 한 분자를 대상으로 여러 샘플에서 화합물의 빠른 분석에 대 한 관련된 간접 경쟁 (ic) ELISA를 만드는 데 필요한을 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 절차 인공 항 원 (즉, hapten-운반대 공액)의 합성, 면역, 세포 융합, 단일 클로 널 hybridoma 준비, mAb, 특성화 고는 mAb의 ELISA 기반 응용 프로그램에 설명합니다. Hapten-운반대 공액 나트륨에 의해 합성 되었다 메서드를 periodate 하 고 MALDI TOF MS에 의해 평가. 예방 접종, 후 splenocytes 가장 높은 항 체 titer로 면역된 한 마우스에서 고립 되었고 hypoxanthine aminopterin 티 미 딘 (모자)-민감한 마우스 myeloma 세포 선 s p 2/0-Ag14 융합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 사용 하 여-방법을 기반으로. Hybridomas 은닉 mAbs 대상 항 원에 반응 특이성 및 분에 대 한 icELISA에 의해 상영 했다. 또한, 제한 희석 메서드는 단일 클로 널 hybridomas 준비에 적용 되었습니다. 최종 mAbs icELISA 특징 추가 되었고 예제 hapten (naringin (NAR)) 자연 제품에서의 신속 하 고 편리한 검출 ELISA 기반 응용 프로그램에서 활용.
Introduction
단일 클론 항 체 (mAbs), 모노-특정 항 체로 알려진 단일 B-lymphocyte 복제에서 생산 되며 모두 동일한 epitope1에 바인딩할 여러차례 항 체의 구성. 최근 몇 년 동안, 많은 약 식물 유래 천연 제품2다양 한 질병 치료에 사용 되었습니다. 실제로, 원래 천연 제품에서 파생 된 많은 작은 분자 화합물 artemisinin 말라리아와 암2,3paciltaxel (taxol) 등 첫 줄 약으로 이제 적용 됩니다. 천연 제품의 연구는 엄청난 개발 및 기존의 분석 기술, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분석 (MS) 등의 최적화 때문에 크게 급속 한 진행을 했다. 그러나, 아직도 이러한 방법으로, 그들의 복잡 한 전처리 프로토콜, 시간, 노동/전문 지식, 및 필요한 악기4에 관하여 관련된 비용 등 관련 된 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
최근, mAb 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 질적 및 양적 분석 음식과 자연 제품 적용 되었습니다. 사실,이 생물 학적 샘플 분석 및 임상 테스트에 적용 된 방법과 또한 다른 분석5와 관련 된 지루한 전처리 단계를 피하 면 서, 민감한, 정확 하 고 고효율로 표시 되었습니다. 6.
MAb 기반 ELISAs를 사용 하 여 복잡 한 천연물 연구, 단일 클론 항 체의 준비 핵심 단계 중 하나입니다. 불행히도, 이러한 유형의 물질6,7,,89,10,11,12에 작은 bioactive 구성 요소에 특정 mAbs ,13,,1415 는 제한 된 단백질 항 원에 비해. 이 문제를 회피, 특히 작은 화합물에 대하여 mAbs를 생성 하는 프로토콜을 개발 했습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 합성 인공 항 원, 마우스 면역, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 단일 클로 널 hybridoma 준비 포함 됩니다.
특히, 우리의 연구 그룹 mAbs 전통 중국 의약품에서 작은 생리 활성 화합물에 대 한 형성을 공부 하 고 수년간 그들의 애플 리 케이 션을 개발 되었습니다는. 우리의 지속적인 연구에 mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic 산18, paeoniflorin19, ginsenoside 다시20, ginsenoside Rh121, 그리고 다른 많은 작은 분자에 대 한 개발 했습니다. 이러한 mAbs에 따라 우리의 ELISA 프로토콜 연구의 숫자에 다른 생리 활성 화합물과 그들의 상호 작용으로 이러한 작은 분자의 약 동학을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 이러한 mAbs를 사용 하 여, 우리는 또한 개발 immunoaffinity 착 색 인쇄기 방법 epimers를 포함 하 여 구조상 아날로그의 분리에 대 한. 최근에, 우리는 우리의 안티-puerarin mAb 이후에 급속 하 고, 현장이 화합물의 검출에 사용 된를 사용 하 여 측면 흐름 immunoassay 준비. 우리의 결과 우리의 mAb 기반 분석 실험 생물학을 공부 하 고 특히 전통 중국 의약품에 사용 된 천연 제품 파생 된 화합물의 품질에 대 한 편리 하 고 필수적인 도구 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리 제시 자연 제품에서 파생 된 작은 분자에 대하여 mAbs의 성공적인 생산을 위한 프로토콜. 절차의 필수적인 단계를 설명 하 고 우리는 예를 들어 작은 분자도 NAR을 사용 하 여이 프로토콜의 유틸리티 증명 하고있다. 예제에서는 스펙트럼, 반응 분석, 및 icELISA 결과 대표 실험 및 제어 가져온 데이터를이 프로토콜을 사용 하 여 표시 합니다. 예제 이미지는 hybridomas의 연구원 해야 있을 원하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81573573, 81473338, 및 81503344)와 고전 처방 기본 연구 팀 베이징 대학에서 중국 의학의 의해 지원 되었다.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
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