Generasjon av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter
Summary
Denne artikkelen inneholder en detaljert protokoll og evaluering av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter for bruk i ulike immunanalyser. Denne fremgangsmåten inneholder immunisering, celle fusion, indirekte konkurransedyktig ELISA for positiv klone screening og monoklonalt hybridoma forberedelse. Spesifikasjonene for antistoff karakterisering ved hjelp MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis og ELISA Analyser tilbys også.
Abstract
Analyse av bioaktive komponenter i mat og naturlige produkter har blitt et populært område av studien på mange felt, inkludert tradisjonell kinesisk medisin og mat sikkerhet/toksikologi. Mange av de klassiske analyseteknikker krever dyrt utstyr og/eller kompetanse. Spesielt har enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) blitt en ny metode for analyse av mat og naturlige produkter. Denne metoden er basert på antistoff-mediert deteksjon av målkomponenter. Men som mange av bioaktive komponenter i naturlige produkter er liten (< 1000 Da) og ikke indusere en immunrespons, opprette monoklonale antistoffer (mAbs) mot dem er ofte vanskelig. I denne protokollen gir vi en detaljert forklaring av trinn kreves for å generere mAbs mot målmolekyler samt de måtte opprette forbundet indirekte konkurransedyktig (ic) ELISA for rask analyse av sammensatt i flere eksempler. Prosedyren beskriver syntese av kunstige antigen (dvs. hapten-carrier konjugert), immunisering, cellen smelting, monoklonalt hybridoma forberedelse, karakterisering av mAb og ELISA-baserte programmet av mAb. Hapten-carrier konjugert ble syntetisert av natrium periodate metoden og vurdert av MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis. Etter immunisering, splenocytes ble isolert fra vaksineres musen med den høyeste antistoff titer og smeltet sammen med hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) – sensitive musen myelom celle linje Sp2/0 – Ag14 bruker en polyetylenglykol (PEG)-basert metode. Hybridomas sekresjon mAbs reaktiv til målet antigen ble vist av icELISA for spesifisitet og kryssreaktivitet. Videre ble begrensende fortynning metoden brukt til å forberede monoklonalt hybridomas. De siste mAbs ble ytterligere preget av icELISA og deretter benyttet i en ELISA-basert applikasjon for rask og praktisk påvisning av eksempel hapten (naringin (NAR)) i naturlige produkter.
Introduction
Monoklonale antistoffer (mAbs), også kjent som mono-spesifikke antistoffer, er produsert av en enkelt B-lymphocyte klone og består av monovalent antistoffer at alle binde til samme epitope1. De siste årene, har mange medisinsk plante-avledet naturlige produkter blitt brukt i behandling av ulike sykdommer2. Faktisk, mange små molekylære forbindelser opprinnelig stammer fra naturlige produkter nå brukes som første linje narkotika, for eksempel artemisinin for malaria og paciltaxel (taxol) for kreft2,3. Studiet av naturlige produkter har gjort raske fremskritt, hovedsakelig på grunn av enorm utvikling og optimalisering av konvensjonelle analyseteknikker, inkludert Væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri (MS). Men det er fortsatt noen begrensninger knyttet til disse metodene, for eksempel komplekse forbehandling protokoller og tilhørende kostnader med hensyn til tid, arbeidskraft/kompetanse og nødvendige instrumenter4.
MAb-baserte enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) har nylig brukt kvalitativt og kvantitativt analysere mat og naturlige produkter. Faktisk, denne metoden er brukt både biologiske prøver analyse og klinisk testing og har vist seg å være nøyaktig, følsom og svært effektiv og også unngå kjedelig forbehandling trinnene forbundet med andre analyser5, 6.
Når du bruker mAb-baserte ELISAs for å studere komplekse naturlige produkter, er utarbeidelse av monoklonale antistoffer en av kjernen trinnene. Dessverre, mAbs gjelder for små bioaktive komponenter i slike stoffer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 er ofte begrenset sammenlignet med protein antigener. For å omgå dette problemet, har vi utviklet en protokoll for å generere spesielt mAbs mot små forbindelser. Protokollen presenteres her inkluderer kunstig antigen syntese, musen immunisering, cellen smelting, indirekte konkurransedyktig ELISA og monoklonalt hybridoma forberedelse.
Vår forskningsgruppe er spesielt studere dannelsen av mAbs mot små bioaktive forbindelser fra tradisjonell kinesisk medisin og utvikle programmene sine for år. I vår pågående studier, har vi utviklet mAbs mot baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic syre18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121og mange andre små molekyler. Våre ELISA protokoller basert på disse mAbs har blitt brukt i en rekke studier vurdere farmakokinetikken av disse små molekyler som deres samhandling med andre bioaktive forbindelser. Videre har bruker disse mAbs, vi også utviklet immunoaffinity kromatografi metoder for separasjon av strukturelle analoger, inkludert epimers. Nylig har forberedt vi en lateral flyt immunanalyse med våre anti-puerarin mAb som ble brukt for rask, stedets påvisning av dette sammensatte. Våre resultater viser at våre mAb-baserte analyser er uunnværlig og praktisk verktøy for å studere biologi og kvalitet av naturlig-produkt-avledet forbindelser, særlig de som brukes i tradisjonell kinesisk medisin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en protokoll for vellykket produksjon av mAbs mot naturlig produkt-avledet små molekyler. De grunnleggende trinnene i prosedyren har vært skissert, og vi har vist nytten av denne protokollen bruker NAR som et eksempel små molekyl. Til eksempel spectra, reaktivitet analyser og icELISA resultater viser representant eksperimentelle og kontrolldata som er hentet ved hjelp av denne protokollen. Eksempel bilder av hybridomas gir en visuell representasjon av hva hun bør se etter når skille mellom de mono…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (grant tall 81573573, 81473338 og 81503344) og klassisk resept grunnleggende forskningsteam ved Beijing University kinesisk medisin.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
