Поколение моноклональных антител против натуральных продуктов
Summary
Эта статья содержит подробный протокол для подготовки и оценки моноклональных антител против натуральных продуктов для использования в различных иммуноанализа. Эта процедура включает в себя иммунизации, слияние клеток, косвенные конкурентные ELISA для положительных клон скрининг и моноклональных гибридомной подготовки. Спецификации для характеризации антитела используя MALDI-TOF-MS и анализа ELISA также предоставляются.
Abstract
Анализ биологически активных компонентов, присутствующих в продукты и натуральные продукты стал популярным области исследования во многих областях, включая традиционной китайской медицины и пищевой безопасности/токсикология. Многие из методов классического анализа требуют дорогостоящего оборудования или опыта. В частности энзим соединенный иммуноферментного анализа (ELISAs) стали возникающих метод для анализа продуктов и натуральных продуктов. Этот метод основан на обнаружении антител опосредованной целевых компонентов. Однако, как многие из биологически активных компонентов в природных продуктах малы (< 1000 да) и не вызывают иммунный ответ, создание моноклональных антител (mAbs) против них часто бывает трудно. В этом протоколе мы предоставляем подробное описание шагов, необходимых для создания mAbs против молекулы-мишени, а также те, которые необходимы для создания связанного косвенные конкурентные (ic) ELISA для быстрого анализа соединения в нескольких образцах. Процедура описывает синтез искусственных антигена (т.е., сопряженное Гаптены перевозчик), иммунизации, слияние клеток, моноклональных гибридомной подготовки, квалификация МАБ и на базе ИФА применение МАБ. Сопряженное Гаптены перевозчик был синтезирован натрия Периодат метод и оценены MALDI-TOF-МС. После иммунизации, splenocytes были изолированы от иммунизированная мышь с высокий титр антител и сливается с гипоксантин аминоптерин тимидина (HAT) – линия клетки миеломы чувствительных мыши Sp2/0 – Ag14 с помощью полиэтиленгликоля (PEG)-на основе метода. Hybridomas секреции mAbs реактивной целевой антигена были экранированы, icELISA специфику и перекрестной реактивности. Кроме того ограничение разведения был применен подготовить моноклональных hybridomas. Окончательный mAbs были также характеризуется icELISA и затем использовать в приложении на основе ELISA для быстрого и удобного обнаружения пример Гаптены (нарингин (нар)) в натуральных продуктов.
Introduction
Моноклональные антитела (mAbs), также известный как моно специфические антитела, производятся из одного клонов лимфоцитов и состоят из моновалентной антител, что все привязки к же эпитоп1. В последние годы множество лекарственных растений, полученных натуральные продукты используются в лечении различных заболеваний2. Действительно многие малые высокомолекулярных соединений, первоначально полученных от натуральных продуктов теперь применяются в качестве первой линии препаратов, таких как артемизинина для малярии и paciltaxel (Таксол) для рака2,3. Изучение природных продуктов достигнут быстрый прогресс, во многом благодаря огромным развития и оптимизации обычных анализа методов, включая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия (МС). Однако есть еще некоторые ограничения, связанные с этими методами, например их сложные протоколы предварительной и связанные с этим расходы в отношении времени, труда/опыт и необходимые инструменты4.
Недавно МАБ основе иммуноферментного анализа (ELISAs) были применены и количественно и качественно проанализировать питание и натуральные продукты. В самом деле этот метод был применен для анализа биологических образцов и клинических испытаний и было показано, чтобы быть точным, чувствительной и высокоэффективных также избегая утомительной предварительной шаги, связанные с другими анализы5, 6.
При использовании на основе МАБ ELISAs изучить комплекс натуральных продуктов, подготовка моноклональных антител является одним из основных шагов. К сожалению mAbs, характерных для малых биологически активных компонентов, присутствующих в этих видов веществ6,,78,9,10,11,12 ,13,,1415 часто ограничены по сравнению с белков антигенов. Чтобы обойти эту проблему, мы разработали протокол к специально генерировать mAbs против малых соединений. Протокол, представленные здесь включает в себя синтез искусственных антигена, мыши иммунизации, слияние клеток, косвенные конкурентные ELISA и моноклональных гибридомной подготовки.
В частности Наша исследовательская группа изучения формирования mAbs против мелких биоактивных соединений из традиционных китайских лекарственных средств и лет разработкой их приложений. В наших исследованиях продолжается мы разработали mAbs против baicalin16, puerarin17, глицирризиновой кислоты18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121и многих других малых молекул. Наши ELISA протоколы, основанные на этих mAbs были использованы в ряде исследований для оценки фармакокинетики этих маленьких молекул, а также их взаимодействия с другими биологически активных соединений. Кроме того использование этих mAbs, мы также разработали иммуноаффинной хроматографии методов для разделения структурных аналогов, в том числе спектральными. Недавно мы подготовили иммуноанализа бокового потока, используя наши МАБ анти puerarin, который впоследствии используется для быстрого, на месте обнаружения этого соединения. Наши результаты показывают, что наш МАБ основе анализов являются незаменимым и удобные инструменты для изучения биологии и качества природных продуктов, полученных соединений, особенно те, которые используются в традиционной китайской медицины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем собой протокол для успешного производства mAbs против натуральных продуктов, полученных малых молекул. Основные шаги в процедуре были изложены, и мы продемонстрировали полезность этого протокола, с помощью NAR как пример маленькой молекулы. Пример спектры, реактивн?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант номера 81573573, 81473338 и 81503344) и классического рецепта основной исследовательской группы в Пекинском университете китайской медицины.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
