Generation av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter
Summary
Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för utarbetande och utvärdering av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter för användning i olika immunanalyser. Denna procedur innefattar immunisering, Cellfusion, indirekta kompetitiva ELISA-test för positiva klon screening och monoklonala Hybridomteknik förberedelse. Specifikationerna för antikropp karakterisering med MALDI-TOF-MS och ELISA analyser finns också.
Abstract
Analysen av de bioaktiva komponenterna som förekommer i livsmedel och naturliga produkter har blivit ett populärt område i studien på många områden, inklusive traditionell kinesisk medicin och mat säkerhet/toxikologi. Många av de klassiska analysmetoder kräver dyr utrustning eller kompetens. Särskilt, blivit enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) en framväxande metod för analys av livsmedel och naturliga produkter. Denna metod är baserad på antikroppsmedierad upptäckt av målkomponenter. Dock så många bioaktiva komponenter i naturliga produkter är små (< 1 000 Da) och framkalla inte ett immunsvar, skapa monoklonala antikroppar (mAbs) mot dem är ofta svårt. I detta protokoll ger vi en utförlig förklaring av de steg som krävs för att generera mAbs mot målmolekyler som behövs för att skapa associerade indirekta konkurrenskraftiga (ic) ELISA för snabb analys av sammansatt i flera prover. Förfarandet beskriver syntes av konstgjorda antigenet (dvs hapten-carrier konjugatet), immunisering, Cellfusion, monoklonala Hybridomteknik förberedelse, karakterisering av mAb och ELISA-baserade tillämpningen av mAb. Hapten-carrier konjugatet var syntetiseras av natrium natriumperjodat metod och utvärderas av MALDI-TOF-MS. Efter immunisering, splenocytes isolerades från immuniserade musen med den högsta antikropp-titern och smält med den hypoxantin-aminopterin-tymidin (HAT) – känslig mus myelom cellinje Sp2/0 – Ag14 använda en polyetylenglykol (PEG)-baserad metod. De hybridomceller utsöndrar mAbs reaktiv till målet antigen screenades av icELISA för specificitet och korsreaktivitet. Dessutom tillämpades den begränsande utspädning metoden för att förbereda monoklonala hybridomceller. De slutliga mAbs var ytterligare kännetecknas av icELISA och sedan utnyttjas i en ELISA-baserat program för snabb och bekväm detektion av till exempel hapten (naringin (NAR)) i naturliga produkter.
Introduction
Monoklonala antikroppar (mAbs), även känd som mono-specifika antikroppar, produceras från en enda B-lymphocyte-klon och består av monovalenta antikroppar som alla binder till samma epitop1. Under de senaste åren har många vegetabiliska naturliga läkemedel använts vid behandling av olika sjukdomar2. Faktiskt, många små molekylära föreningar som ursprungligen härrör från naturliga produkter nu tillämpas som första linjens läkemedel, såsom artemisinin mot malaria och paciltaxel (taxol) för cancer2,3. Studier av naturliga produkter har gjort snabba framsteg, till stor del på grund av enorm utveckling och optimering av konventionella analystekniker, inklusive högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och masspektrometri (MS). Det finns dock fortfarande vissa begränsningar som är associerade med dessa metoder, såsom deras komplexa förbehandling protokoll och tillhörande kostnader avseende tid, labor/expertis och nödvändiga instrument4.
MAb-baserade enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) har nyligen tillämpats för att kvalitativt och kvantitativt analysera mat och naturliga produkter. I själva verket, denna metod har tillämpats för både biologiska prover analys och kliniska tester och har visat sig vara korrekt, känslig och högeffektiva samtidigt också undvika de tråkiga förbehandling stegen i samband med andra analyser5, 6.
När du använder mAb-baserade Elisa för att studera komplexa naturliga produkter, är förberedelse av monoklonala antikroppar ett av de grundläggande stegen. Tyvärr, mAbs specifika för de små bioaktiva komponenterna i dessa typer av ämnen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 är ofta begränsade jämfört med proteinantigener. För att kringgå problemet, har vi utvecklat ett protokoll för att specifikt generera mAbs mot små föreningar. Det protokoll som presenteras här innehåller konstgjorda antigen syntes, mus immunisering, Cellfusion, indirekta kompetitivt ELISA och monoklonala Hybridomteknik förberedelse.
Bland annat har vår forskargrupp studera bildandet av mAbs mot små bioaktiva föreningar från traditionell kinesisk medicin och utveckla sina program i år. I vår pågående studier, har vi utvecklat mAbs mot baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic syra18, paeoniflorin19, ginsenosid Re20, ginsenosid Rh121och många andra små molekyler. Våra ELISA-protokoll baserat på dessa mAbs har använts i ett antal studier för att utvärdera farmakokinetiken av dessa små molekyler samt deras interaktioner med andra bioaktiva föreningar. Dessutom har använder dessa mAbs, vi också utvecklat immunoaffinity kromatografi metoder för separation av strukturella analoger, inklusive epimers. Nyligen har förberett vi en lateral flow immunoassay med användande av vår anti-puerarin mAb som användes därefter för snabb, hotellets detektion av denna förening. Våra resultat visar att våra mAb-baserade analyser är oumbärlig och bekvämt verktyg för att studera biologi och kvalitet av naturlig-produkt-härledda föreningar, särskilt de som används i traditionell kinesisk medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för den framgångsrika tillverkningen av mAbs mot naturliga produkt-derived små molekyler. De grundläggande stegen i förfarandet har beskrivits, och vi har visat nyttan av detta protokoll som använder NAR som ett exempel liten molekyl. Till exempel spectra, reaktivitet analyser och icELISA resultat visar alla representant experimentella och kontrolldata som erhålls med hjälp av detta protokoll. Exempel bilder av hybridomceller ger en visuell representation av vad forskaren ska let…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (grant nummer 81573573, 81473338 och 81503344) och klassiskt recept grundläggande forskargruppen vid Beijing University i kinesisk medicin.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
