Isolation og kultur af gnaver mikroglia at fremme en dynamisk forgrenet morfologi i serumfrit Medium

Summary

Bestræbelser på at forstå microglial funktion i detaljer har været hæmmet af manglen på microglial kultur modeller, at sammenfatte egenskaberne af modne i vivo mikroglia. Denne protokol beskriver en isolation og kultur tilgang har til formål at fastholde robuste overlevelse af stærkt forgrenet modne rotte mikroglia defineret-medium betingelser.

Abstract

Mikroglia udgør 5-10% af alle centrale nervesystem (CNS) celler og i stigende grad henlede opmærksomheden på grund af deres bidrag under udvikling, homøostase, og sygdom. Selvom makrofager er blevet studeret i detaljer i årtier, specialiserede funktioner i mikroglia, væv-resident makrofager i CNS, forblevet stort set mystiske, delvis på grund af begrænsninger i evnen til at sammenfatte modne microglial egenskaber i kultur. Her viser vi en enkel procedure for hurtig isolering af ren mikroglia fra modne gnaver hjernen. Vi beskriver også serumfrit dyrkningsbetingelser, der understøtter høje niveauer af microglial rentabilitet over tid. Mikroglia kulturperler disse defineret-medium betingelser udviser omfattende forgrenet processer og dynamiske overvågning adfærd. Vi illustrere nogle effekter af serum eksponering på kulturperler mikroglia og drøfte, hvordan disse serumfrit kulturer sammenlignet med både serum-eksponerede kulturer samt mikroglia in vivo.

Introduction

Som makrofager af CNS parenkym, mikroglia interagere med en bred vifte af neuronal kredsløb og glial signaling netværk. De spiller en vital rolle i udvikling og homøostase i hjernen gennem synaptic beskæring, apoptotiske celle clearance og forbigående interaktioner med neuronal processer^1,2. Mikroglia er tidlige respondere til Neurologiske skader, udvide deres lange, tynde processer til læsion websteder til at koordinere inflammatoriske respons og begrænse blødning^3,4. Ændringer i microglial morfologi og funktion er allestedsnærværende i både akutte og kroniske CNS skader, og mikroglia udstille ændret morfologi, lokalisering og udtryk af inflammatoriske mediatorer i en bred vifte af sygdom stater¹. Menneskets genetiske undersøgelser tyder på, at mutationer, der ændrer risiko for neurodegenerative sygdomme er ofte hovedsagelig eller udelukkende udtrykt af mikroglia i intakt CNS, peger på en afgørende rolle for mikroglia i sygdom patogenese eller progression⁵ . I betragtning af deres fremtrædende plads i skader og sygdom, er fremme forståelsen af microglial biologi en høj prioritet for at udvikle nye behandlingsformer.

Mange kritiske forskud til forståelsen af microglial biologi er opstået ved at ekstrapolere teknikker og mekanismer opdaget i undersøgelser af andre makrofag populationer herunder kultur metoder, gene expression profiler og definitioner af funktionelle / morfologiske stater. Selvom generaliseret makrofag funktioner spiller ofte på overraskende måder inden for CNS landskab, mikroglia er selv højt specialiserede, udstiller en forgrenet morfologi og en enestående gen expression signatur, der adskiller dem fra andre væv makrofager⁶. Mikroglia har en afstamning, der adskiller sig fra de fleste andre væv makrofager; de kolonisere CNS under en tidlig embryonale bølge af primitiv bloddannelsen og selv forny hele liv, uafhængigt af bidrag fra endelige bloddannelsen⁷. Fuldt modne gen expression underskrift voksen mikroglia opnås ikke indtil den anden postnatal uge⁸. Miljømæssige signaler fra det omkringliggende væv spiller en stor rolle i dikterer væv-specifikke makrofag funktioner⁶, som i CNS omfatter begrænset eksponering for blodbårne faktorer ydet af blod – hjerne barrieren⁹.

En hindring for fuldt ud at forstå microglial bidrag til CNS homøostase og sygdom er vanskeligheden ved recapitulating de specialiserede egenskaber af modne mikroglia set i vivo med oprensede celler in vitro-. Mange metoder er blevet udviklet for at isolere og kultur intakt mikroglia, men de fleste tilgange stole på serum til at støtte celle overlevelse. Vi har vist, at tilsætning af serum, der er en iboende variable reagens, der indeholder en bred vifte af bioaktive molekyler, er særligt problematisk, når arbejdet med mikroglia fordi det fremmer en amoeboid morfologi, øget spredning, og øget fagocytose⁹ ses ofte i vivo når mikroglia udsættes for blod båret faktorer efter afbrydelse af blod – hjerne barrieren. Af disse målinger, serum-eksponerede celler ligner mikroglia skade eller sygdom stater, men sådanne ændringer er reduceret Hvornår mikroglia er kulturperler i definerede vækstmedium, der indeholder CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol og selenite.

Denne protokol giver detaljer dyrkning juvenile rotte mikroglia under serumfrit betingelser relateret til nyligt offentliggjorte arbejde⁹. Denne protokol er blevet strømlinet for rotter fra postnatal dag 21-30 (P21 – P30), men kan tilpasses til at isolere mikroglia fra rotter og mus i enhver alder, selv om udbyttet og overordnede rentabilitet vil variere afhængigt af arterne af og alder af dyr. Maksimal udbytter og optimal rentabilitet opnås ved brug af lidt umodne mikroglia (~ P9), udbytter og levedygtighed gradvis smallere til en noget lavere niveauer hos voksne dyr. Mikroglia kan også isoleres fra mus, men vi har fundet, at rotte celler viser betydeligt højere udbytter, levedygtighed og kompleksiteten af forgrenet morfologier, sammenlignet med musen celler i serumfrit kulturer. Dyr på større end P50 er ikke blevet evalueret med denne protokol. Denne immunopanning isolation procedure er blevet optimeret, at minimere ændringer i microglial transcriptional profiler under isolation og maksimere downstream levedygtighed af celler. Ved hjælp af disse teknikker og medier formuleringer, kan høj-levedygtighed primære kulturer opretholdes i ugevis. Mikroglia kulturperler disse betingelser udviser en stærkt forgrenet morfologi med hurtig udvidelse og sammentrækning af processer og lave relativt priser af spredning. Vi fremhæve betydningen af serum-eksponering på disse egenskaber, og diskutere styrker og svagheder ved denne metode i forhold til andre metoder.

Protocol

Alle procedurer, der involverer gnavere i overensstemmelse med retningslinjerne for Stanford University, som er i overholder med nationale og statslige love og politikker. Alle dyr procedurer blev godkendt af Stanford University’s Administrative Panel for Laboratory Animal Care. Bemærk: Alle løsning og buffer kompositioner leveres i Tabel af materialer. 1. Forbered en petriskål for CD11b Immunopanning (dag 0) Bemærk: Fo…

Representative Results

Denne protokol beskriver en metode til kultur høj renhed forgrenet mikroglia fra unge rotter. Lignende resultater kan opnås ved hjælp af umodne, perinatal og voksne dyr, som drøftet nedenfor. Da cellen isolering omfatter ofte subtile nuancer og mange muligheder for celler til at dø, brugte vi kvalitetskontrol checkpoints til at hjælpe med at bestemme succes på forskellige trin. Vi overvågede typisk celle suspensioner ved hjælp af en hemocytometer på flere trin i isolation protok…

Discussion

Fordi mikroglia tjene som sentinel immunceller af CNS, er de meget lydhøre over for miljømæssige ændringer; derfor for stor omhu at minimere inflammatoriske reaktioner i cellerne under deres isolation og kultur⁸. Dette opnås i denne protokol gennem hastighed og temperatur. At holde cellerne på is eller ved 4 ° C, når det er muligt i høj grad reducerer aktivering, så alle centrifugering trin finde sted ved 4 ° C, dyrene er perfunderet med iskold perfusion buffer, og protokollen er blevet…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.