Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Summary

Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.

Abstract

La microglie représentent 5 à 10 % de toutes les cellules du système nerveux central (SNC) et sont plus en plus attirant l’attention en raison de leurs contributions au cours de développement, l’homéostasie et la maladie. Bien que les macrophages ont été étudiés en détail pour des décennies, des fonctionnalités spécialisées des microglies, les macrophages tissulaires-résident du SNC, sont restés en grande partie mystérieuse, en partie à cause de limitations dans la capacité de récapituler des microglies mature biens immobiliers à la culture. Ici, nous montrons une procédure simple et directe pour l’isolement rapide de pure microglie du cerveau mature rongeur. Nous décrivons également les conditions de culture sans sérum qui prennent en charge des niveaux élevés de viabilité microgliales au fil du temps. Cultivées dans ces conditions de milieu défini la microglie pièce complexes processus ramifiés et comportement dynamique de surveillance. Nous illustrons quelques effets de l’exposition de sérum sur des microglies culture et examiner comment ces cultures sans sérum comparent à la fois exposés au sérum de cultures ainsi que la microglie in vivo.

Introduction

Comme les macrophages du parenchyme CNS, microglie interagir avec une vaste gamme de circuit neuronal et gliales réseaux de signalisation. Ils jouent un rôle vital dans le développement et l’homéostasie du cerveau par élagage synaptique, dégagement de cellules apoptotiques et transitoires interactions avec les processus neuronaux^1,2. Les microglies sont premiers intervenants de lésions neurologiques, étendre leurs processus longs et minces aux sites de la lésion pour coordonner les réactions inflammatoires et de limiter les saignements^3,4. Changements dans la morphologie des microglies et la fonction sont omniprésents dans les blessures de CNS aiguës et chroniques et la microglie pièce modifiée morphologie, localisation et l’expression de médiateurs inflammatoires dans un large éventail d’États de maladie¹. Des études génétiques humains indiquent que les mutations qui modifient le risque de maladies neurodégénératives sont souvent principalement ou exclusivement exprimées par la microglie dans le SNC intact, pointant vers un rôle critique pour la microglie dans la pathogenèse de la maladie ou la progression⁵ . Compte tenu de leur importance dans les blessures et les maladies, favoriser la compréhension de la biologie de la microglie est hautement prioritaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Nombreuses avancées essentielles à la compréhension de la biologie des microglies ont surgi en extrapolant des techniques et mécanismes découverts dans les études d’autres populations de macrophage, y compris les méthodes de culture, profils d’expression génique et définitions de fonctionnelle / morphologiques États. Bien que généralisée macrophage fonctions souvent se dérouler de façon surprenante dans le paysage de la CNS, les microglies sont elles-mêmes hautement spécialisé, présentant une morphologie ramifiée et une signature d’expression de gène unique qui les distingue des autres tissus macrophages⁶. La microglie ont une lignée qui se distingue de la plupart des autres macrophages tissulaires ; ils colonisent le système nerveux central au cours d’une vague embryonnaire précoce de l’hématopoïèse primitif et se renouvellement tout au long de la vie, indépendamment des contributions de l’hématopoïèse définitive⁷. La signature d’expression de gène de pleine maturité des microglies adulte n’est pas atteint jusqu’à la deuxième semaine après la naissance⁸. Les signaux environnementaux des tissus environnants jouent un rôle majeur en dictant des macrophages de tissu-spécifiques caractéristiques⁶, qui dans le système nerveux central comprend une exposition limitée à facteurs hématogène accordée par la barrière hémato – encéphalique⁹.

Un obstacle pour comprendre pleinement microgliales contributions à l’homéostasie du CNS et de la maladie est la difficulté de récapitulant les propriétés spécialisées des microglies mature vu en vivo avec cellules purifiées in vitro. Plusieurs méthodes ont été développées pour isoler et culture microglie intacte, mais la plupart des approches dépendent de sérum à l’appui de la survie des cellules. Nous avons montré que l’addition de sérum, qui est un réactif par nature variable contenant une vaste gamme de molécules bioactives, est particulièrement problématique lorsque travailler avec les cellules microgliales parce qu’elle encourage une morphologie amiboïde, augmente la prolifération, et phagocytose accrue⁹ a souvent vu dans vivo quand microglie sont exposés à des facteurs de diffusion hématogène après la rupture de la barrière hémato – encéphalique. Par ces mesures, exposés au sérum de cellules ressemblent à des microglies de blessures ou de maladies, mais ces altérations sont réduites quand les microglies sont cultivées en milieu défini contenant du CSF-1 (ou IL-34), le TGF-β, cholestérol et sélénite.

Ce protocole fournit des détails pour la culture des microglies rat juvénile dans des conditions sans sérum, associés à des travaux récemment publiés⁹. Ce protocole a été simplifié pour les rats de jour après la naissance 21-30 (P21 – P30), mais peut être adapté pour isoler la microglie de rats et de souris de n’importe quel âge, bien que le rendement et la viabilité globale variera selon l’espèce et l’âge de l’animal. Rendement maximal et viabilité optimale est obtenue lors de l’utilisation des microglies légèrement immatures (~ P9), avec des rendements et de la viabilité s’amenuisant progressivement à un peu plus faibles chez les animaux adultes. Microglies peuvent aussi être isolé chez des souris, mais nous avons trouvé que des cellules de rat montrent des rendements significativement plus élevée, la viabilité et complexité des morphologies ramifiés, comparativement aux cellules de la souris dans les cultures sans sérum. Animaux âgés de plus de P50 n’ont pas été évalués avec ce protocole. Cette procédure d’isolement d’immunopanning a été optimisée afin de minimiser les variations des profils transcriptionnelle microgliales lors de l’isolation et de maximiser la viabilité des cellules en aval. En utilisant ces techniques et les formulations de médias, des cultures primaires de haute-viabilité peuvent être maintenues pendant des semaines. Cultivées dans ces conditions la microglie présentent une morphologie très ramifiée impliquant rapide et la rentrée des processus et relativement faible taux de prolifération. Nous mettre en évidence l’importance du sérum-exposition sur ces propriétés et discuter des points forts et les faiblesses de cette méthode par rapport à d’autres approches.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l’Université de Stanford, conformes aux politiques et lois étatiques et nationales. Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur la protection des animaux de laboratoire. NOTE : Toutes les compositions de solution et le tampon sont fournies dans la Table des matières. 1. Préparez une…

Representative Results

Ce protocole décrit une méthode de culture haute pureté ramifiée microglie de jeunes rats. Résultats similaires peuvent être obtenus utilisant des animaux immatures, périnatales et adultes, tel que discuté ci-dessous. Étant donné que l’isolement de cellules comprendre souvent des nuances subtiles et nombreuses possibilités pour les cellules à mourir, nous avons utilisé points de contrôle de contrôle de la qualité pour aider à déterminer le succès à différentes étap…

Discussion

Parce que les cellules microgliales servent de cellules immunitaires sentinelles du SNC, ils sont très sensibles aux changements environnementaux ; par conséquent, grand soin est nécessaire pour minimiser les réactions inflammatoires dans les cellules au cours de leur isolement et de culture⁸. Ceci est accompli dans le présent protocole par le biais de vitesse et de température. Chaque fois que possible réduit considérablement l’activation, donc toutes les étapes de centrifugation ont …

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.