Isolering och kultur av gnagare mikroglia att främja en dynamisk förgrenad morfologi i serumfritt Medium

Summary

Ansträngningar för att förstå mikrogliala funktion i detalj har hindrats av bristen på mikrogliala kultur modeller som sammanfatta egenskaperna för mogna i vivo mikroglia. Det här protokollet beskriver en isolering och kultur strategi för att upprätthålla robusta överlevnad av starkt förgrenat mogen råtta mikroglia definieras-medium villkor.

Abstract

Mikroglia utgör 5-10% av alla celler i centrala nervsystemet (CNS) och drar alltmer uppmärksamhet på grund av deras bidrag under utveckling, homeostas och sjukdom. Även om makrofager har studerats i detalj för årtionden, specialiserade funktioner av mikroglia, vävnad bosatta makrofager i CNS, har förblivit i stort sett mystiska, delvis på grund av begränsningar i förmågan att sammanfatta mogen mikrogliala boenden i kultur. Här visar vi ett enkelt förfarande för snabb isolering av ren mikroglia från mogna gnagare hjärnan. Vi beskriver också serumfritt odlingsbetingelser som stöder höga nivåer av mikrogliala lönsamhet över tid. Mikroglia odlade under dessa definieras-medium förhållanden uppvisar genomarbetade förgrenat processer och dynamisk övervakning beteende. Vi illustrerar vissa effekter av serumexponering på odlade mikroglia och diskutera hur dessa serumfritt kulturer jämfört med såväl serum-exponerade kulturer som mikroglia i vivo.

Introduction

Som makrofager av CNS parenkymet, mikroglia interagera med ett brett spektrum av neuronala kretsar och gliaceller signalering nätverk. De spelar avgörande roller i utveckling och homeostas av hjärnan via synaptic beskärning, apoptotiska cell clearance och övergående interaktioner med neuronala processer^1,2. Mikroglia är tidiga responders till neurologiska skador, utvidga deras långa, tunna processer till lesion platser att samordna inflammatoriskt svar och begränsa blödning^3,4. Förändringar i mikrogliala morfologi och funktion är allestädes närvarande i både akuta och kroniska CNS-skador och mikroglia utställning förändrad morfologi, lokalisering och uttryck av inflammatoriska mediatorer i ett varierat utbud av sjukdom stater¹. Människans genetiska studier visar att mutationer som förändrar risken för neurodegenerativa sjukdomar uttrycks ofta huvudsakligen eller uteslutande av mikroglia i intakt CNS, pekar till en kritisk roll för mikroglia i sjukdomspatogenes eller progression⁵ . Med tanke på deras framträdande i skador och sjukdom, är främja förståelsen av mikrogliala biologi en hög prioritet för att utveckla nya behandlingsmetoder.

Många viktiga framsteg för förståelsen av mikrogliala biologi har uppstått genom att extrapolera tekniker och mekanism upptäcktes i studier av andra makrofag befolkningar, inklusive kultur metoder, gen uttryck profiler och definitioner av funktionella / morfologiska stater. Även om generell makrofag funktioner spelar ofta på överraskande sätt inom CNS landskapet, mikroglia är själva mycket specialiserad, uppvisar ett förgrenat morfologi och en unik gen uttryck signatur som skiljer dem från andra vävnader makrofager⁶. Mikroglia har en härstamning som skiljer sig från de flesta andra vävnad makrofager; de kolonisera CNS under en tidig embryonal våg av primitiva blodbildningen och själv förnya hela livet, oberoende av bidrag från slutgiltig blodbildning⁷. Fullt mogen gen uttryck signaturen av adult mikroglia uppnås inte förrän den andra postnatala vecka⁸. Miljömässiga ledtrådar från den omgivande vävnaden spela en viktig roll i dikterar vävnadsspecifika makrofag funktioner⁶, vilket i CNS inkluderar begränsad exponering för blodburna faktorer som beviljats av den blood – brain barriär⁹.

Ett hinder för att fullt ut förstå mikrogliala bidrag till CNS homeostas och sjukdom är svårigheten att går igenom specialiserade egenskaper för mogna mikroglia sett i vivo med renat celler in vitro-. Många metoder har utvecklats för att isolera och kultur intakt mikroglia, men de flesta metoder förlitar sig på serum att stödja cellöverlevnad. Vi har visat att tillägg av serum, som är ett inneboende variabel reagens som innehåller en stor mängd bioaktiva molekyler, är särskilt problematiskt när man arbetar med mikroglia eftersom det främjar en amoeboid morfologi, ökad spridning, och ökad fagocytos⁹ ses ofta i vivo när mikroglia utsätts för blodburna faktorer efter störningar av den blod – hjärnbarriären. Av dessa mätvärden, serum-exponerade celler liknar mikroglia i skador eller sjukdomstillstånd, men sådana förändringar reduceras när mikroglia odlas i definierade odlingsmedium som innehåller CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol och selenit.

Detta protokoll ger Detaljer för odling juvenil råtta mikroglia serumfritt villkor relaterade till nyligen publicerade arbete⁹. Detta protokoll har effektiviserats för råttor från den 21-30 (P21 – P30), men kan anpassas till isolera mikroglia från råttor och möss i alla åldrar, även avkastning och övergripande lönsamhet varierar beroende på art och djurets ålder. Maximal avkastning och optimal lönsamhet uppnås när du använder något omogen mikroglia (~ P9), avkastning och livskraftiga gradvis avsmalnande till något lägre nivåer i vuxna djur. Mikroglia kan också isoleras från möss, men vi har funnit att råtta celler visar betydligt högre avkastningen, livskraft och komplexiteten i förgrenat morfologier, jämfört med musen celler i serumfritt kulturer. Djur år större än P50 har inte utvärderats med detta protokoll. Proceduren immunopanning isolering har optimerats att minimera förändringar i mikrogliala transkriptionell profiler under isolering och maximera nedströms livskraften hos cellerna. Använda dessa tekniker och medier formuleringar, kan hög-livskraft primära kulturer upprätthållas i veckor. Mikroglia odlade under dessa förhållanden uppvisar ett starkt förgrenat morfologi som involverar snabba förlängning och indragning av processer och låga relativt priser för spridning. Vi framhålla betydelsen av serum-exponering på dessa egenskaper och diskuterar styrkor och svagheter med denna metod i förhållande till andra metoder.

Protocol

Alla förfaranden som rör gnagare överensstämde till Stanford University riktlinjer, som uppfyller nationella och statliga lagar och politik. Alla djur förfaranden godkändes av Stanford University administrativa panelen på laboratorium djur vård. Obs: Alla lösning och buffert kompositioner finns i Tabell för material. 1. Förbered en petriskål för CD11b Immunopanning (dag 0) Obs: Förbereda 1 immunopanning maträ…

Representative Results

Det här protokollet beskriver en metod att kultur hög renhet förgrenad mikroglia från juvenila råttor. Liknande resultat kan erhållas med hjälp av omogna, perinatal och vuxna djur, som diskuteras nedan. Eftersom cellen isoleringar innehåller ofta subtila nyanserna och många möjligheter för cellerna att dö, använde vi kvalitetskontroll kontrollpunkter för att fastställa framgång vid olika steg. Vi övervakas vanligtvis cellsuspensioner använder en hemocytometer på flera s…

Discussion

Eftersom mikroglia fungera som sentinel immunceller i CNS, är de mycket lyhörda för förändringar i miljön; Därför krävs stor omsorg för att minimera inflammatoriska reaktioner i cellerna under deras isolering och kultur⁸. Detta sker i detta protokoll genom fart och temperatur. Att hålla cellerna på is eller vid 4 ° C närhelst möjligt minskar aktiveringen, så alla centrifugering steg ske vid 4 ° C, djuren är perfusion med iskall perfusion buffert och protokollet har effektiviserat…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.