소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

Summary

여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

Abstract

선명도의 개발 이후 기술 삭제 bioelectrochemical 수 있는 3 차원 표현 형 매핑 투명 한 조직 내의 다양 한 큐빅 (명확 하 고 가리지 뇌 이미징 등 새로운 개간 방법론에 대 한 칵테일 및 전산 분석), 스위치 (상호 작용 시간의 시스템 제어) 및 화학 제품의 활동, 지도 (확대는 프로테옴의 분석), 및 협정 (수동 선명도 기술)에 대 한 기존의 툴킷 확대 설립 되었습니다 생물학 직물의 현미경 분석입니다. 현재 향상 하 고 전체 중앙 신경 시스템 (CNS), 신장, 비장, 그리고 전체 마우스 배아를 포함 하 여 그대로 설치류 조직의 배열에 대 한 원래 협정 절차를 최적화 하는 것을 목표로 공부 합니다. PsPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정) 되 나, 이러한 소설 기법 셀 회로 고 그대로 정상 및 병 적인 조직에서 subcellular 구조 시각화의 높은 효능 수단을 제공 합니다. 다음 프로토콜에서 우리는 psPACT 및 mPACT 통해 그들의 구조적 무결성의 최소한의 침공으로 최대한 조직 허가 달성 하는 방법에 세부, 단계별 개요를 제공 합니다.

Introduction

과학 및 임상 조회의 근본적인 목적은 관련 기관의 구조와 기능;의 완벽 한 이해를 달성 그러나, 포유류 장기의 상당히 복잡 한 자연 완전히이 목표¹을 달성 하는 방 벽으로 수시로 제공 합니다. 명확성 (명확한 지질 교환 아크릴 때 교배 엄밀한 이미징 호환 Tisssue-하이드로 겔)^2,3,4, 건물 그대로 조직에서 히드로 아크릴 기반 하이브리드 포함, 달성 다양 한 기관, 뇌, 간, 그리고 비장를 포함 하 여⁵그들의 구조적 무결성 유지 하면서 광학 정리. 선명도 시각화 뿐만 아니라 복잡 한 셀룰러 네트워크 및 단면 필요 없이 조직 형태학을 정밀 하 게 해 부를 기회에 따라서 사용할 수 있습니다.

조직 허가 달성 하기 위해 선명도 샘플의 지질 콘텐츠 제거 하 전기 이동 방법을 사용 합니다. 물리적으로 안정적인 조직-히드로 하이브리드 생산에 대 한 선명도 지적 하는 동안 연구 전기 이동 조직 개간 (등) 방법의 사용 조직 품질, 브라우닝, epitope 손상을 포함 한 변수 결과 산출 하 고 단백질 손실^5,6. 이러한 문제를 해결 하려면 수동, 이온-세제 기반된 delipidation 기술 등 치료를 대체 하는 협정 (수동 선명도 기술) 등 수정된 프로토콜 개발된^7,,89되었습니다. 그러나 결과에 더 일관성을 달성에 불구 하 고, 협정 최대한 정리를 얻기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. 또한, 이러한 기술의 아무도 아직 적용 되었을 전체 CNS 양식 또는 쥐 및 기니 피그와 같은 큰 설치류 모델.

현재 연구는 psPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정), 전체 CNS와 마우스와 쥐 모델¹⁰에 내부 장기의 빠른 통관을 촉진을 위한 새로운 방법론을 제안 하 여 이러한 한계를 해결 하고자 합니다. 특히, psPACT 처리 조직 4% 아크릴에 0.25% 하이드로 겔 형성; 하는 동안 두 개의 별도 단계에서 버지니아-044 mPACT는 기본적으로 동일한 단계를 수행 하지만 키 시 약으로 서 0.5% α-thioglycerol와 개간 SDS 기반 솔루션을 보완. 두 기술을 마구 크게 광학 클리어런스를 생산 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 내 생 적인 조직 및 cerebrospinal 순환 시스템. 원리의 증거로, 허가 조직¹⁰혈관 패턴 분석에 confocal 현미경 검사 법의 사용을 설명 합니다.

Protocol

모든 절차는 연 세 대학 의과대학에서 적절 한 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 연 세 대학 대학의과 대학에 실험실 동물 관리 위원회의 지침에 따라 모든 실험 동물을 희생 한다. 1입니다. 시 약의 준비 주의: Paraformaldehyde (PFA), 아크릴 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 개인 보호 장비 (PPE; 실험실 외 투, 장갑, 보호 ?…

Representative Results

최적화 된 수동 청소 기술을 사용 하 여 전체 CNS의 투명 한 모델의 생성 마우스와 쥐 전체 CNS 조직의 광 정리 빠른 속도로 다양 한 수동 개간 기법 (그림 1)를 사용 하 여 달성 되었다. 조직 시간이 지남에 비운의 회로도 그림 2A에 표시 됩니다. 원래 협정 메서드와 달리 psP…

Discussion

수동, 전기 이동 비 추출 방법에 고용 하는 동안 협정 크게 이전 조직 삭제 선명도^2,3,,47 같은 방법으로 달성 일관성 향상 ^{, 8}, 기술은 여전히 가장 눌러 최대한 조직 선명도¹²를 달성 하는 데 필요한 시간의 길이 여러 가지 단점을 맺는 다. 현재 연구에서 선물…

Materials

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Affymetrix, Inc.	75819	Clearing solution
Nycodenz	Axia-Shield	1002424	nRIMS solution
40% Acrylamide Solution	Bio Rad Laboratories, Inc.	161-0140	Polymerization (A4P0)
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	017-19362	Polymerization (VA-044)
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753-100ML	Clearing solution (mPACT)
Tween-20	Georgiachem	9005-64-5	nRIMS solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML	Immuno Staining
Bovine serum albumin (BSA)	Bovogen	BSA100	Immuno Staining
Heparin	Merck Millipore	375095	Perfusion (PBS)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-25G	nRIMS solution
PECAM-CD31 antibody	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-28188	Immuno Staining
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate	Jackson ImmunoResearch Inc.	111-165-003	Immuno Staining
4% Paraformaldehyde	Tech & Innovation	BPP-9004	Perfusion, Polymerization
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)	Tech & Innovation	BPB-9121	Perfusion, Buffer
10 mL stripette	Coatar	4488	Solution transfer
50 mL tube	Falcon	352070	Clearing tube
35 mm Cell culture dish	SPL	20035	Imaging
Confocal dish	SPL	211350	Imaging
1 mL syringe	Korea vaccine Co., Ltd	26G 1/2	Anesthetize
50 mL syringe	Korea vaccine Co., Ltd	21G1 1/4	Perfusion
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A3553	Polymerization (A4P0)
Whatman 3MM paper	Sigma-Aldrich	Z270849	Blotting paper for gel removal
Confocal microscope	Zeiss	LSM780	Imaging
ZEN lite Software	Zeiss	ZEN 2012	Imaging
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-1F	Perfusion
EasyGel	Lifecanvas Technologies	EasyGel	Tissue gel hybridization system