Romanen passiv fjerne metoder for rask produksjon av optisk åpenhet i hele CNS vev
Summary
Her presenterer vi to nye metoder, psPACT og mPACT, for å oppnå maksimal optisk åpenhet og påfølgende microscopic analyse av vev blodkar i intakt gnager hele CNS.
Abstract
Siden utviklingen av KLARHET, en bioelectrochemical fjerne teknikk som gir tredimensjonale fenotypen kartlegging i gjennomsiktig vev, en rekke romanen clearing metoder inkludert KUBIKKMETER (klar og uhindret hjernen imaging cocktailer og beregningsorientert analyse), SWITCH (systemomfattende kontroll samhandling tid) og kinetics av kjemikalier, kart (forstørret analyse av proteom) og PAKTEN (passiv klarhet teknikk), er etablert for å ytterligere utvide et eksisterende verktøysett for mikroskopisk analyse av biologisk vev. Dagens studie sikte på å forbedre og optimalisere opprinnelige PAKTEN prosedyren for en rekke intakt gnager vev, inkludert hele sentralnervesystemet (CNS), nyrer, milt og hele mouse embryoer. Kalles psPACT (prosess-atskilt PAKTEN) og mPACT (endret PAKTEN), gir disse nye teknikkene svært effektiv måte å kartlegging celle krets og visualisere subcellular strukturer intakt normal og patologisk vev. I den følgende protokollen gir vi en detaljert, trinnvis oversikt på hvordan å oppnå maksimal vev klarering med minimal invasjonen av deres konstruksjonssikkerhet via psPACT og mPACT.
Introduction
En grunnleggende målet med vitenskapelige og kliniske forespørsel innebærer å oppnå en fullstendig forståelse av orgel struktur og funksjon; imidlertid fungerer meget komplisert natur pattedyr organer ofte som en barriere å fullt oppnå denne mål1. KLARHET (klart Lipid-byttet akrylamid-hybridiserte stive Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, som involverer en akrylamid-baserte hydrogel hybrid fra intakt vev, oppnår optisk klarering av forskjellige organer, inkludert hjernen, leveren og milten, samtidig som deres konstruksjonssikkerhet5. KLARHET har dermed aktivert ikke bare visualisering, men også muligheten til å fint dissekere komplekse mobilnettverk og vev morphologies uten behov for snitting.
For å oppnå vev klaring, sysselsetter KLARHET electrophoretic metodene for å fjerne lipid innholdet i utvalget for hånden. Mens KLARHET har vært nevnt for å produsere fysisk stabil vev-hydrogel hybrider, studier har vist at bruken av electrophoretic vev clearing (ETC) metoder gir variable resultater i vevet kvalitet, inkludert browning, epitope skade, og protein tap5,6. For å løse disse problemene, har endret protokoller som PAKTEN (passiv klarhet teknikk), som erstatter ETC behandling med en passiv, jonisk-rengjøringsmiddel basert delipidation teknikk, vært utviklet7,8,9. Til tross for å oppnå en mer konsekvent resultater, men krever PAKTEN mer tid å få maksimal klaring. Videre er ingen av disse teknikkene enda brukt i hele CNS-skjemaet eller i større gnager modeller som rotter og marsvin.
Studien søker å håndtere disse begrensningene ved å foreslå nye metoder, psPACT (prosess-atskilt PAKTEN) og mPACT (endret PAKTEN), for å tilrettelegge rask rydding av hele CNS og indre organer i både mus og rotte modeller10. Spesielt psPACT behandler vev i 4% akrylamid og 0,25% VA-044 i to separate trinn under hydrogel formasjon; mPACT i hovedsak innebærer de samme trinnene, men kosttilskudd SDS-baserte clearing løsningen med 0,5% α-thioglycerol som en nøkkel reagens. Begge teknikkene utnytte de endogene systemisk og cerebrospinal sirkulasjons systemene for å redusere tiden det tar å produsere optisk klaring. Som et bevis på prinsippet viser vi bruk av AC confocal mikroskopi analysere blodkar mønstre i ryddet vev10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens metodene passive, ikke-electrophoretic utvinning ansatt i forbedret PAKTEN konsistens med tidligere vev fjerne metoder som KLARHET2,3,4,7 , 8, teknikken fortsatt bærer flere svakheter, de mest presserende som er tiden som kreves for å oppnå maksimal vev klarhet12. I denne studien presenterer vi endret PAKTEN protokoller som redu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av hjernen Korea 21 pluss prosjektet for medisinsk vitenskap, Yonsei universitet. I tillegg ble dette arbeidet støttet av et stipend fra det nasjonale Research Foundation av Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
Referências
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
