在这里,我们描述了在成年大鼠的第9胸腔水平上产生可靠的脊髓侧缺(HX)的外科手术,以及旨在检测这种单方面损伤后非对称缺陷的神经行为评估。
不完全的脊髓损伤(SCI)经常导致感觉运动功能受损,在临床上是SCI最常见的类型。 人Brown-Séquard综合征是一种常见的不完全SCI,由脊髓的一半病变引起,导致与损伤相同的(或益普西病变)侧的瘫痪和异位丧失,以及相反(或反向病变)疼痛和感觉温度的丧失。产生脊髓侧性造养(HX)和评估神经损伤的适当方法对于建立布朗-塞夸德综合征的可靠动物模型至关重要。虽然横向造反模型在基础和转化研究中起着关键作用,但缺乏建立这种造反截面和评估单边作用的标准化方案。本研究的目的是描述分步程序,在第9胸(T9)椎骨水平上产生大鼠脊柱侧HX。然后,我们描述了 HX (CBS-HX) 的组合行为量表,该量表为单边 SCI 提供对非对称神经性能的简单而敏感的评估。CBS-HX 从 0 到 18 不等,由 4 个单独评估组成,包括单边后肢步进 (UHS)、耦合、接触放置和网格行走。对于 CBS-HX,分别评估 ipsi 侧和反向后肢。我们发现,在T9 HX之后,ipsi边后肢表现出行为功能受损,而反向后肢则表现出实质性恢复。CBS-HX有效地区分了ipsi边和反向后肢之间的行为功能,并检测到ipsi边后肢恢复的时间进展。CBS-HX 组件可以单独分析,也可以在需要时与其他测量措施结合使用。虽然我们只提供了外科手术的视觉描述和胸部HX的行为评估,该原理可能适用于其他不完整的SCIs和伤害的其他水平。
不完全的脊髓损伤(SCI)往往导致传感器运动功能的严重和持续损伤,是临床上最常见的SCI1类型。人类的Brown-Séquard综合征是由脊髓一半的病变引起的,导致与损伤相同的(或益体)侧出现瘫痪和丧失异位感,而对相反(或反向病变)一侧,3,疼痛和温度感觉的丧失。脊柱侧半度动物模型被广泛用于模仿人类布朗-塞夸德综合征,它们被报告在大鼠55,6,7,8,9,6,7,8,9负鼠10和猴子7,117,11,12,13由各种实验室在不同脊柱水平。,12,13然而,没有描述生产标准横向横断的详细可视化程序。为横向横断提供分步程序应优化模型,促进基础和转化研究中实验结果的比较或复制。
单方面 SCI 产生不对称和不成比例的行为缺陷,难以使用常规评估来测量对称伤害。评估单边SCI的神经损伤的适当方法是开发单边SCI模型的重要组成部分。尽管单侧脊柱损伤起到了关键作用,但缺乏评估有这种损伤的动物的感官运动缺陷的标准化方案。巴索-贝蒂-布雷斯纳汉(BBB)运动额定尺度是SCI之后成人大鼠14中最常用的功能测量,它对整个运动产生了半定量的描述。然而,它不单独测量每个后肢。
在这项研究中,我们报告分步程序,在第9胸(T9)椎骨水平上产生啮齿动物脊柱HX。我们还引入了半部(CBS-HX)的综合行为量表,包括单边后肢步进 (UHS)、耦合、放置接触和网格行走评估,用于评估单侧 SCI 后的神经损伤和恢复。我们希望这种模式将成为检查单方面SCIs损伤机制和治疗效果的有用模式。
在这项研究中,我们报告分步程序,在成年大鼠中生产一种简单、一致和可重复的T9脊柱HX,模仿人类的布朗-塞夸德综合症。我们进一步引入了一个合并行为评分系统,用于半截(CBS-HX),该系统对评估非对称神经损伤和恢复进展非常敏感,通过单边后肢步进 (UHS)、耦合 (CPL) 的组合进行测量,放置接触,和网格行走。虽然我们演示了T9级别的损伤,但此过程可以简单且毫无要求的方式应用于脊髓的其他地区,包括颈椎和腰椎线。我们希望这种模式,以及单边行为评估,将有助于检查损伤机制和治疗效果的这类SCI。
由于横向 HX 模型仅损伤电源线的 ipsi 边一半,因此电源线的反面部分在很大程度上保留下来,可用作内部控制。许多下降和上升路径是单方面投影的,在许多情况下,横向横断对一侧的斧头道造成损害,并保留对另一侧的同一条道,从而便于比较重组和这些区域在同一动物的功能后果。此外,产生一个更局部的病变可能允许特定路径的定位。例如,心室和心室病变可能影响脊柱和前脑脊柱通路。背或背侧病变可能影响皮质脊柱和红脊柱通路。横截或部分损伤模型也可用于研究其他通路的解剖学和功能,如脊柱、神经质或血清素通路。因此,通过感官亲和力、下降路径和内在脊柱回路,可以独一无二地利用同质图模型来研究补偿。该模型还适用于HX后locomotor恢复机制的探讨。
横向 HX 导致明显的行为障碍,这些障碍可在运动任务(例如,Treadscan 或跑步机)范式下评估,用于自动步态分析19。此外,可利用电生理记录测量病变对病变的对方的斧头道的电导率,这种评价提供了在各种治疗后建立功能重组的可能性。此外,单方将解剖示踪剂注射到特定路径的神经元中,可以可视化贴有标记的中线交叉纤维及其与逆行标记的神经元20、21、22、23、24、25的连接。20,21,22,23,24,25
虽然典型的脊柱 HX 手术需要不到 20 分钟才能完成,但需要一些练习才能达到精确且一致的 HX。首先,重要的是,脊椎HX水平在动物和动物中是一致的。因此,确定用于层压切除术的适当椎部段至关重要。其次,确保 HX 已完成。要制作完整的 HX,可以使用垂直插入中线的 30 轨针来使用微剪刀来指导切割。针插入还可避免损伤后脊髓血管或脊髓的病变。30 量表针的第二个功能是,它可以作为一把刀来跟踪切口,以确保没有病变的歧义。第三,将明胶放在病变部位可以最大限度地减少脑脊液泄漏,将水泥放在明胶顶部,桥接椎膜可以增强病变部位脊柱的稳定性,促进伤口愈合。为了避免信号干扰应用电生理记录,肌肉,筋膜和皮肤应缝合在层与4-0丝线。最后,应尽一切努力尽量减少对反向脊髓的损害。应建立组织验证,以确认一侧的完全横向半部,并另一侧另一侧的电源线另一半保存(如图 6E所示)。
为了改善SCI后的运动,以前的研究采用了广泛的策略,包括细胞移植、斧子再生8、18、26、2718,26,27和基于活动的康复828、29、30。 28,29,30同时,已经建立了几个行为测试,用于功能评估,并筛选SCI之后的最佳治疗方法。BBB运动额定等级表旨在评估脊柱对称损伤,如中线挫伤或截断损伤,影响双肢14、31。 14,BBB的某些参数,如协调和脚趾间隙,通过观察后肢进行记录。如果一个后肢完好无损,另一个显示非对称损伤的缺失,那么完整的后肢会混淆受影响的后肢的分数。由于BBB评分在单方受伤后不能容纳另一个后肢得分,因此对评估单侧脊髓损伤并不理想。但是,如果每侧的关节运动和重量支撑单独评估,并且不作为 BBB 的一部分计算,则完整的后肢(类似于假控制)不会混淆受影响后肢的分数。此外,完整的一面不会偏袒动物的整体得分,因为完整的后肢在关节运动、体重支撑或步进方面没有戏剧性的缺陷。
精化图的组合行为评分被设计为在侧部横截大鼠模型中对行为恢复的敏感且易于执行的评估。它可用于评估早期和晚期恢复行为。早期阶段在受伤后7-10天内。在HX后的头3-5天,ipsi边后肢活动稳步增加,应更频繁地评估,以记录自发或治疗介导的后肢运动恢复。到HX后5-7天,大鼠开始在没有体重支撑的情况下进行横扫后肢运动。到了7-10天,老鼠通常开始站立和步。在此阶段,应注意步进模式。在晚期(14-28天),ipsi侧后肢活动稳定,接近正常。
还应密切注意耦合 (CPL) 容量。CPL 测试(步态耦合)可以在开场测试期间使用视频(例如,Treadscan/Catwalk)或拍摄视频执行。第二个选项提供了灵活性,如果研究人员不能访问步态分析系统。对于两个视频录制会话,此测试至少需要每只脚连续两次触摸。对于分析,有三个耦合参数:同源、同边和对角耦合(步骤 6.2)。每个耦合都涉及一个参考脚和给定的脚。以同源耦合(左前右前,或左后右)为例,它是给定脚的第一次接触时间除以参考脚的整个步幅时间。由于左脚和右脚应出相,因此完美的耦合应为 0.5。在同边耦合(左前后后,或右右右后后),这是相同的情况。但是,对于对角耦合(左前右后,或右左后),完美的耦合应为 0 或 1,因为两英尺应处于相位。在步骤 6.4 中,我们为每个 CPL 分配分数从 0 到 2。在细节上,分数 0 应表示给定的脚无法移动完成接触,因此没有 CPL;分数 1 表示任何不规则或笨拙的 CPL,因为给定的脚完成一个触地,但不是在完美的耦合;分数 2 表示 0.5 的完美耦合。三个耦合参数概念在前面的出版物32,33,33中得到了很好的描述。CPL 可与触点放置和网格行走的评估相结合。组合行为评分系统的单个组件在SCI的不同大鼠模型中或多或少是有效的。对于CPL,赤字在交替率和序列完整性中变得明显可见。在单边HX之后,可明显揭示的自知性后肢赤字。在我们的研究中,所有大鼠都显示益皮性后肢出现缺陷,而反向后肢放置则没有缺陷。当接触放置(涉及皮质脊柱区域)开始恢复时,应考虑网格行走测试。为了排除任何可能的疲劳问题,行为测试序列可以在每次测试中随机化。
最后,我们报告分步程序,以创建一个可重现的体内大鼠模型的T9脊柱HX,模仿布朗-塞夸德综合征在人类。半切的综合行为评分系统为评估单方面SCI后的伤害机制和治疗提供了一个更歧视性的个体后肢行为结果的鉴别性测量。虽然我们只提供外科手术的视觉描述和胸部HX的行为评估,但此处描述的方法可能适用于不同损伤级别的其他不完整的 SCIs。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢杰弗里·雷基亚-里夫先生的出色技术援助。这项工作得到了济南军区总医院院长基金会的大力支持,2016ZD03和2014ZX01(XJL和TBZ)。徐实验室的研究得到NIH 1R01 100531、1R01 NS103481、美国退伍军人事务部I01 BX002356、I01 BX003705、I01 RX002687优秀奖的支持。
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