Бульон Microdilution в пробирке скрининга: легкий и быстрый метод для обнаружения новых противогрибковых соединений
Summary
Метод microdilution легко и адаптируемая бульон для скрининга противогрибковые соединения и экстрактов.
Abstract
Грибковые инфекции стали важной медицинской состояние в последние десятилетия, однако количество доступных противогрибковых препаратов ограничено. В этом случае необходим поиск новых противогрибковых препаратов. Протокол, сообщили здесь подробно метод для экрана пептиды для их противогрибковые свойства. Он основан на тест восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов клинической и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 с изменениями с учетом исследование антимикробных пептидов как потенциальных новых противогрибковых препаратов. Этот протокол описывает функционального анализа оценить деятельность противогрибковые соединений и могут быть легко изменены в соответствии любого конкретного класса молекул под следствием. Так как анализы выполняются в 96-луночных пластины с помощью небольших объемов, крупномасштабные скрининга может быть завершена в короткий промежуток времени, особенно если осуществляется в обстановке автоматизации. Эта процедура показывает, как стандартизированный и регулируемые клинический протокол может помочь скамейке работа стремлении улучшить терапии грибковых заболеваний новых молекул.
Introduction
Грибковые инфекции стали важной медицинской проблемой в последние десятилетия, значительно увеличив обусловлено главным образом увеличением числа лиц с ослабленным иммунитетом как тех, кто проходит лечение рака и людей, живущих с ВИЧ/СПИДом или пересадки органов1,2. Однако весьма ограниченный спектр доступных противогрибковых препаратов и увеличение числа сообщений о грибковых сопротивление их вклад основных проблем относительно терапии системных микозов3.
Потенциальный источник новых соединений, противогрибковые, антимикробных пептидов (AMPs), малые катионных пептидов, производимые многих организмов как часть их врожденной иммунной реакции на инфекции4. Тем не менее метод скрининга, чтобы проверить эти соединения против грибковых патогенов не нормируется. Различные процедуры были использованы для оценки Противогрибковая активность AMPs, иногда для же модель микроорганизма5,6,7. Эти различия и отсутствие подробной информации в некоторые протоколы осложнить сравнений между соединений и препятствует воспроизводимость.
Одним из способов для стандартизации тестирования новых наркотиков кандидатов является придерживаться руководящих принципов, используемый для определения противогрибковые восприимчивость в клинических условиях, таких как клиническая и лаборатории Института стандартов (CLSI) M27-A3 руководящих принципов. Однако эти испытания противогрибковые чувствительность носят слишком ограничительный характер и не принимать во внимание изменения в метаболизме различных видов, как они были установлены только для нескольких агентов. Например они не принимают во внимание метаболические потребности не брожения дрожжей.
Этот протокол позволяет оценки деятельности перспективных соединений, противогрибковые и реализуется здесь для поиска противогрибковые пептиды. Он основан на тест восприимчивости microdilution бульон из руководящих принципов CLSI M27-A3 с изменениями, которые оптимизируют скрининга новых соединений8,9. Эти изменения позволяют использовать небольшое количество смеси, различия в температуре или первоначальный посевным материалом и различные средства массовой информации для оптимального роста перед тестированием, одновременно стандартизируя результаты с использованием справочных противогрибковые препараты, как элементы управления. Этот метод, с использованием нескольких хорошо культуры пластин, позволяет быстро и надежно экран большое количество соединений.
Из-за присущего гибкости этот протокол может использоваться с различными классами химических соединений и против других микроорганизмов, с несколько адаптаций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution тесты могут анализировать потенциальные Противогрибковая активность целевого объекта соединения, с помощью небольших количествах соединения и в то же время протестировать его в диапазоне концентраций. Соответственно этот протокол рекомендуется в качестве первого шага в скр?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим накидки-Бразилия, CNPq-Бразилия, FAP/DF для финансовой поддержки. Мы благодарны д-р Уго Коста Паес для пересмотра рукопись.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
Referências
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
