Denne protokol beskriver i detaljer hvordan at fabrikere og drive mikrofluid enheder til røntgen diffraktion dataindsamling ved stuetemperatur. Desuden, den beskriver hvordan man kan overvåge protein krystallisering af dynamisk lysspredning og hvordan til at behandle og analysere opnået diffraktion data.
Denne protokol beskriver opdigte mikrofluid enheder med lav X-ray baggrund optimeret for goniometer baseret fast mål seriel krystallografi. Enhederne er mønstret fra epoxy lim. ved hjælp af bløde litografi og egner sig til i situ røntgen diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur. Prøven brønde er låg på begge sider med polymere polyimid folie windows, der tillader diffraktion dataindsamling med lav X-ray baggrund. Denne fabrikation metode er krævende og billig. Efter indkøb af en SU-8 master wafer, kan alle fabrikation fuldføres uden for et renrum i en typisk research laboratoriemiljø. Chip design og fabrikation protokollen udnytte kapillær ventilfunktionen til microfluidically delt en vandig reaktion i definerede nanoliter størrelse dråber. Denne ladning mekanisme forhindrer prøven tab fra kanal døde-volumen og kan nemt udføres manuelt uden at bruge pumper eller andet udstyr til væske aktivering. Vi beskriver, hvordan isolerede nanoliter størrelse dråber protein løsning kan være overvåget i situ af dynamiske lys spredning til kontrol protein krystal Nukleering og vækst. Efter passende krystaller er vokset, kan komplet røntgen diffraktion datasæt indsamles ved hjælp af goniometer baseret i situ faste mål seriel uorganisk kemi ved stuetemperatur. Protokollen indeholder brugerdefinerede scripts til at behandle diffraktion datasæt ved hjælp af en suite af softwareværktøjer til at løse og forfine protein krystalstruktur. Denne metode undgår de artefakter muligvis induceret under cryo-bevarelse eller manuel krystal håndtering i konventionelle krystallografi eksperimenter. Vi præsentere og sammenligne tre proteinstrukturer, som blev løst ved hjælp af små krystaller med dimensioner på ca 10-20 µm vokset i chip. Af crystallizing og diffracting i situ, håndtering og dermed mekaniske forstyrrelser af skrøbelige krystaller er minimeret. Protokollen detaljer om, hvordan til at fabrikere en brugerdefineret X-ray gennemsigtige mikrofluid chip egnet til i situ seriel krystallografi. Som næsten alle crystal kan bruges til indsamling af diffraktion, er disse mikrofluid chips en meget effektiv krystal leveringsmetode.
At kende 3D-struktur af en protein er vigtigt at forstå dens funktionalitet. I nærheden af atomic opløsning strukturer er hidtil oftest fremstillet ved røntgenkrystallografi. Denne teknik udsætter protein krystaller til X-ray stråling og de resulterende diffraktion mønstre er derefter analyseret for struktur beslutsomhed og raffinement. I traditionelle røntgenkrystallografi registreres en komplet diffraktion datasæt fra en enkelt, ideelt store, krystal på kryogene temperaturer. Sådanne krystaller, er dog for det meste ikke trivielt at vokse, og til at identificere egnede cryo-bevarelse betingelser kan blive udfordrende i sig selv og kan undertiden også forårsage afvigelser fra nativt protein struktur5.
Seneste teknologiske fremskridt inden for X-ray fri-elektron laser (FEL) og synkrotron beamlines har lov til at løse strukturer fra mindre krystaller, som nye mikro-fokusering beamlines, øget X-ray stråle glans, og forbedret røntgendetektorer blev tilgængelige6,7. Små krystaller er typisk lettere at dyrke end store og defekt frie krystaller8,9. Men små krystaller lider af X-ray strålingsskader meget hurtigere end store krystaller. Dette er fordi i forhold til en stor krystal, en højere X-ray dosis skal være projiceret ind i en mindre krystal volumen til diffract til sammenlignelige opløsning. Selv kryogene beskyttelse er derfor ofte ikke tilstrækkelig til at optage et komplet diffraktion datasæt fra en enkelt microcrystal.
For at overvinde denne forhindring, er seriel krystallografi blevet metoden til at samle og flette diffraktion mønstre fra mange tilfældigt orienterede microcrystals at opnå en komplet datasæt. Stråling induceret krystal skader er minimeret ved at sprede den samlede X-ray dosis anvendes til at løse et protein struktur over et stort antal krystaller5,10. I en ‘ diffract før ødelægge ‘ FEL eksperiment, hver crystal bruges kun til én eksponering ved hjælp af femtosekund sekund X-ray pulser. Mikro-fokus beamlines på tredje generation synkrotron kilder kan igen udføre seriel krystallografi med et par millisekund kort X-ray engagementer11,12,13,14. Uden en krystal svingning eller rotation under dataindsamling, dog kun delvis Bragg refleksioner kan registreres og dermed titusinder eller mere diffraktion mønstre er typisk kræves for struktur bestemmelse15. Til dato har er et mangfoldigt sæt af prøven leveringsmetoder blevet udviklet for serielle krystallografi, som for nylig gennemgik14,16,17,18,19. Blandt dem, flere faste-målet baseret prøve levering strategier blev med held kombineret med krystal rotation under X-ray engagementer så betydeligt færre diffraktion mønstre kan give lige så komplette datasæt samtidig også forbruge mindre prøven i forhold til klassisk serie krystallografi eksperimenter hvor stillbillederne er registreret7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi præsenterer en protokol til at fabrikere mikrofluid enheder med lav X-ray baggrund. Enhederne er mønstret fra 5-minutters epoxy lim. ved hjælp af bløde litografi og er velegnet til in situ røntgen diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur, drage fordel af integrere prøveforberedelsen direkte i X-ray set-up, som tilfældet med tidsopløst undersøgelser, der følger blanding-induceret kinetik18,19. Mikrofluid kanaler er låg på begge sider med polymere polyimid folie, hvilket resulterer i X-ray windows med en samlet tykkelse på ca. 16 µm, der giver mulighed for lav røntgenoptagelser baggrund. Alle anvendte materialer giver god solvent modstand. Denne fabrikation metode er forholdsvis enkel og billig. Efter indkøb af en SU-8 master wafer, kan alle fabrikation fuldføres uden for et renrum i en typisk research lab indstilling.
I et ansøgning eksempel beskriver vi chips for goniometer baseret fast mål seriel krystallografi. Første diskuteres design og fabrikation overvejelser for brug af kapillar ventilfunktionen til microfluidically delt en vandig reaktion i en række udvalgte nanoliter størrelse dråber. Denne ladning mekanisme forhindrer prøven tab fra kanal døde-volumen og opdeling kan nemt udføres manuelt uden at bruge pumper eller andet udstyr til væske aktivering. Sådan isoleret nanoliter størrelse dråber af protein løsning er overvåget i situ ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) til kontrol protein krystal Nukleering og vækst. Det er tidligere påvist, at DLS målinger kan udføres i mikrofluid enheder bestående af en Polydimethylsiloxan (PDMS) struktur, bundet til et glas dias25,26. Fordi polyimid lag har en høj transmission for bølgelængder længere end 550 nm, metoden kan udvides til målinger i X-ray gennemsigtige chips, når du bruger en passende laser bølgelængde27,28. Baseret på DLS resultater, indledende Nukleering kan iagttages, og yderligere droplet fordampning kan stoppes for at opnå færre men større protein krystaller.
Efter tilstrækkelig krystaller er vokset, kan komplet røntgen diffraktion datasæt derefter indsamles ved hjælp af goniometer baseret i situ faste mål seriel uorganisk kemi ved stuetemperatur. Diffraktion datasæt behandles ved hjælp af en suite af software-værktøjer og brugerdefinerede scripts til at løse protein krystalstruktur. Denne teknik undgår artefakter ofte induceret under cryo-bevarelse konventionelle krystallografi forsøgsdyr.
Vi sammenligner tre protein target strukturer, der blev løst ved hjælp af om 10-20 µm små krystaller vokset i chip til bedre derefter 2 Å opløsning. Af crystallizing og diffracting i situ, håndtering og dermed mekaniske forstyrrelser af skrøbelige krystaller er minimeret. Denne protokol kan anvendes for protein krystaller, som diffract til høj opløsning samt lav opløsning (1,7 Å til 3.0 Å). Som næsten alle crystal kan bruges til diffraktion, er lille stikprøve spildt, hvilket gør dette til en meget effektiv krystal leveringsmetode.
Denne protokol indeholder en detaljeret vejledning i at forberede i situ protein krystallisering og diffraktion dataindsamling X-ray gennemsigtige mikrofluid chips. Proceduren var omhyggeligt designet til at drage fordel af mikrofluid præcision uden at det kræver avanceret udstyr i laboratoriet. Også, dataindsamling på synkrotron beamline kan udføres uden at det kræver en specialiseret goniometer eller luftfugter at lette reproducere resultaterne af ikke-eksperter. Den præsenteres teknik kan anvendes til seriel millisekund krystallografi dataindsamling ved stuetemperatur samtidig med at stråling skaden minimal og uden at indføre stress til krystallerne efter vækst af cryo-beskyttelse eller krystal håndtering. Den beskrevne metode er derfor velegnet til ethvert protein krystallisering projekt.
Vi fabrikere mikrofluid enheder for i situ røntgen diffraktion af mønster epoxyharpiks som fylde materiale og polyimid folie som vindue materiale. Vores procedure optimeret forskellige trin af fabrikationsproces over tidligere X-ray chip designs16,21. Vi reduceret vindue tykkelse og derved baggrunden spredning samtidig også lette fabrikation som færre procestrin er påkrævet. i situ krystallisering ved hjælp af beskrevet protokollen har betydelige fordele. Det giver mulighed for diffraktion dataindsamling ved stuetemperatur og udelukker derved brug af cryo beskyttelse, hvilket i nogle tilfælde indeholder risikoen for indslæbning af artefakter i protein struktur. Derudover er krystallerne ikke underlagt fysiske stress, fordi overførslen af krystallerne fra deres indfødte miljø kan undgås. Gennem denne procedure krystallerne opretholde deres højeste kvalitet og lider ikke af nogen form for behandling.
Vores erfaring kredser de mest kritiske trin i protokollen omkring styring af krystallisering processen. Parametre at opnå X-ray egnet krystaller med passende dimensioner skal identificeres empirisk og ikke kan tages direkte fra vapor diffusion eksperimenter. Ved hjælp af identiske koncentrationer af protein og fældningsmiddel resulterede ikke altid i krystaller i forskellige chips, eller til tider i forskellige brønde inden for samme chip. Dette angiver, at alle faktorer, der påvirker krystal Nukleering og vækst bør overvejes nøje, som mor liquor sammensætning eller krystallisering kinetik (gennem fordampning bane). Som større krystaller diffract til højere opløsning, dyrkes ideelt passende store krystaller. Processen med krystal Nukleering og vækst kan følges med DLS målinger. Justere laser fokus inde ~ 50 µm tynde krystallisering rum chip kan være udfordrende og måske kræver omhyggelig Manuel justering. Ved hjælp af brønde dybere end 100 µm, var laser auto-justering gennemførlige og pålidelig, således at flere brønde kan overvåges via automatiseret erhvervelse ordninger.
Polyimid baseret X-ray chips producerer kun en lav baggrund og vi demonstrere egnetheden af disse anordninger til rutine røntgen diffraktion dataindsamling ved at løse strukturer for tre model proteiner. Den bedste opløsning fremstillet i chip afveg, sammenlignet med tidligere opnåede resolutioner fra betydeligt større protein krystaller og konventionelle røntgen dataindsamling. Dette kan skyldes flere faktorer og krystallisering betingelse optimering yderligere kan forbedre diffraktion. Det var muligt at indsamle i situ diffraktion data op til 1,8 Å opløsning udlignende krystal med dimensioner mindre end 30 µm. En detaljeret analyse af thaumatin diffraktion data givet indsigt om strålingsskader. For at begrænse omfanget af strålingsskader, skal kun en enkelt krystal udsættes pr. rum i enhedens mikrofluid som diffusion af radikaler og i tilstødende krystaller kan forekomme. For at forbedre hastigheden af dataindsamling, skal dette automatiseres i fremtiden.
På grund af krystal morfologi, i nogle tilfælde kan en foretrukne orientering forekomme. Det var for eksempel tilfældet med thioredoxin datasæt, hvor krystaller havde en stærkt foretrukne orientering i forhold til vinduerne chip. Selv her kunne vi samle et komplet diffraktion datasæt. Hvis krystaller udviser en foretrukne orientering i chip og især hvis tilsvarende plads gruppen har også en lav symmetri, derefter fuldstændigheden af datasættet bør overvåges under samlingen som tilstrækkelig diffraktion mønstre cane indsamlet.
Tidsopløst undersøgelser ved hjælp af disse chips er direkte muligt når ved hjælp af lys fremkaldt reaktioner med en pumpe-sonde tilgang. Polyimid folie lystransmission for pumpen laser skal være belyst og alternativt optisk klare polyimid eller COC kunne bruges. De nuværende mikrofluid geometrier tillader ikke for substrat blanding eksperimenter efter krystaller er vokset. Vi forventer dog beskrevet X-ray chip fabrikation protokollen skal også være egnet til sådan blanding designs for begge tidsopløst røntgen diffraktion samt spredning tilgange19.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af PIER frø fonden PIF-2015-46, BMBF grants 05K16GUA og 05K12GU3, og ‘The Hamburg centrum for ultrahurtig Imaging-struktur, dynamik og kontrol af sagen på atomare skala’ excellence klynge af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Arbejdet i forfattere tilknyttet Center for fri-elektron Laser videnskab blev finansieret af Helmholtz Association gennem orienterede midler. Synkrotron MX data blev indsamlet på beamline P14 drives af EMBL Hamburg på PETRA III storage ring (DESY, Hamburg, Tyskland).
SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
Isopropyl alcohol | Solvent | ||
Ethanol | Solvent | ||
Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
Photo mask | JD Photo Data | ||
3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
Zentrifuge | Eppendorf | ||
Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
Form2 | Formlabs | 3D printer | |
Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |